论文部分内容阅读
研究目的雷奈酸锶(Strontium ranelate,Sr)是一种用于治疗骨质疏松的新型药物,它具有使大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)向成骨细胞方向转化的作用,除此之外,它还有改善骨强度,促进新生血管形成等其它重要的功能。研究表明Sr可通过细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2)和P38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路调节成骨细胞特异性转录因子Runx2(Cbfal)的转录活性,Runx2则调节下游成骨基因,如骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Ⅱ型胶原(Collagen type Ⅱ,COL Ⅱ)的表达,促进BMSCs的成骨分化。转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是属于转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员之一,它有着极其广泛的生物学功能,不仅调控rBMSCs的生长发育和分化,而且能促进rBMSCs向成骨细胞的发育和转化,调控成骨细胞的生长发育和增殖,在合成骨基质和形成骨重建方面也起着重要的作用,是调控rBMSCs生长发育和向成骨细胞分化的首选的生长因子之一；它还可参与调控多种细胞的生长发育和生物学功能。相关资料表明,TGF-β1可能在锶促进rBMSCs向成骨细胞分化的过程中起着重要的作用。但是,TGF-β1在Sr促进rBMSCs向成骨细胞分化中的作用如何迄今未见报道。本文旨在重点探讨：①Sr对rBMSCs的TGF-β1表达的影响；②TGF-β1是否在Sr促进rBMSCs向成骨细胞分化中起作用,以便为Sr的促成骨作用机制提供新颖的实验资料。研究方法1.建立rBMSCs体外分离、培养的方法体系。取四周龄,雌雄不限SD大鼠,取出大鼠双侧的股骨,胫骨,用全骨髓贴壁的方法分离出rBMSCs,用含培养液的10m1注射器从大鼠骨髓中将rBMSCs从骨髓中冲洗出来,直至骨髓腔发白,将收集好的细胞悬液离心,去上清,置于25cm2培养瓶中,并于37℃、5%C02、饱和湿度培养箱培养,当细胞铺满瓶底80%左右时进行传代培养和适当的冻存。并取第3-5代的细胞用于实验。用倒置显微镜观察细胞生长发育状态,并鉴定所培养的细胞为骨髓间充质干细胞。2.定向诱导rBMSCs向成骨细胞分化取生长状态良好的第3-5代rBMSCs,调整其浓度为105/ml左右,取细胞悬液4ml接种,并用成骨诱导液(含10-8的地塞米松,0.2mM的维生素C,10mMβ-甘油磷酸钠)培养,当细胞融合达到60%-70%时,进行实验操作。3.实验分组(1)碱性磷酸酶(ALP)指标测定的实验分组①分为六组,分别设不同的浓度诱导rBMSCs,分别为对照组、Sr=0.1、Sr=l、Sr=3、Sr=5、Sr=7mM,每组设5复孔,六组均在成骨诱导液条件下诱导rBMSCs7天。当Sr=3mM时,ALP活性最大。②分为五组,分别为对照组：成骨诱导液培养；Sr组：3mM Sr+成骨诱导液培养；Sr+SB组：Sr+SB431542+成骨诱导液：先用10gmol/L SB431542(TGF-β1抑制剂)预处理rBMSCs2小时,然后加3mM Sr；SB431542组：SB431542+成骨诱导液：先用10μmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时；DMSO组：DMSO+成骨诱导液,用10μmol/LDMSO培养；共培养rBMSCs7天,测定ALP活性。(2)茜素红钙结节染色的实验分组①分为两组,分别设不同的浓度诱导rBMSCs。对照组：用成骨诱导液培养；Sr组：3mM Sr+成骨诱导液,共培养21天。②分为五组,分别为对照组：成骨诱导液培养；Sr组：3mM Sr+成骨诱导液；Sr+SB431542组：Sr+SB431542+成骨诱导液,先用10gmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时,然后加3mM Sr；SB431542组：SB431542+成骨诱导液：先用10μmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时；DMSO+成骨诱导液组：用10μmol/LDMSO培养：共培养rBMSCs21天,测定钙结节数目。(3)TGF-β1蛋白表达的实验分组①分为六组,分别设不同的浓度诱导rBMSCs.分为对照组、Sr=0.1、Sr=1、Sr=3、Sr=5、Sr=7mM六组,在成骨诱导液中培养7天。当Sr=l mM时,TGF-β1蛋白表达最高。②分为六组,分别设不同的时间诱导rBMSCs.分为对照组、t=1、t=3、t=5、t=7、t=10天六组。各组中所用Sr=l mM。当t=7天时,TGF-β1蛋白表达最高。③分为五组,分别为对照组：用成骨诱导液培养；Sr组：1mM Sr+成骨诱导液；Sr+SB431542组：Sr+SB431542+成骨诱导液,先用10μmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时,然后加1mM Sr；SB431542组：10μmol/L SB431542+成骨诱导液：先用10μmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时；DMSO组：DMSO+成骨诱导液,用10μmol/LDMSO培养；共培养rBMSCs7天,用western-blot检测TGF-β1蛋白表达情况。(4) Runx2mRNA表达情况分组①分为六组,分别设不同的浓度诱导rBMSCs。对照组、Sr=1、Sr=2、Sr=5、Sr=7、Sr=10mM六组,在成骨诱导液中培养7天。当Sr=l mM时,Runx2mRNA表达最高。②分为八组,分别设不同的时间诱导rBMSCs。对照组、t=0.5h、t=1h、t=2h、t=4h、t=3d、t=7d、t=14d。各组所用Sr=l mM。当t=7天时,Runx2mRNA表达最高。③分为五组,分别为对照组：用成骨诱导液培养；Sr组：1mM Sr+成骨诱导液；Sr+SB431542组：Sr+SB431542+成骨诱导液,先用10μmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时,然后加1mM Sr；SB431542组：10μmol/L SB431542+成骨诱导液：先用10μmol/L SB431542预处理rBMSCs2小时；DMSO组：DMSO+成骨诱导液,用10μmol/LDMSO培养；共培养rBMSCs7天,PT-PCR检测Runx2mRNA表达情况。研究结果1、大鼠骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置相差显微镜观察显示：rBMSCs的接种初期可见大量圆形的悬浮细胞。随培养时间的延长,细胞形状渐趋向于多角形或梭形,大多数细胞在24小时之内贴壁,这一代细胞为原代细胞,当原代细胞培养至一星期左右时,细胞贴壁可达70%-80%；经过多次细胞换液后,我们发现细胞形态逐渐趋向一种,呈成纤维样细胞,当细胞逐渐融合之后,呈漩涡状、辐射状。当细胞融合至80%左右,应按1：2的比例传代。2、Sr增加rBMSCs的ALP活性应用浓度分别为0、0.1、1、3、5、7mM的Sr分别处理rBMSCs7天,测定ALP的OD值。应用单因素方差分析显示总体均数间有显著统计学差异(F=44.092,P<0.001),各组与对照组相比均能增加rBMSCs ALP活性(P<0.05),其中当Sr的浓度为3mM时,rBMSCsALP活性的作用最大,与各组相比较均有统计学意义(P<0.05)；在用3mM Sr处理细胞前2小时,应用10μmol/LSB431542预处理rBMSCs,共培养7天,测定ALP的OD值。应用单因素方差分析显示总体均数间有显著统计学差异(F=5.053,P<0.001)。应用3mM Sr处理细胞7天可明显增加ALP活性,与各组比较,差异具有统计学意义(P<0.01),在用3mM Sr处理细胞前2小时,应用10μmol/L SB431542预处理rBMSCs,可明显地抑制Sr对ALP活性的促进作用,与Sr组比较,差异有统计学意义(P<0.05),对照组、SB431542组、DMSO组三组间无统计学意义(P>0.05)。3、Sr促进rBMSCs的钙结节形成应用浓度分别为0、3mM Sr分别处理rBMSCs21天。应用独立样本T检验显示当我们用3mM Sr作用rBMSCs21天时,可明显增加钙结节数量,与对照相比较有统计学差异(t=-9.865,P<0.001)；在3mM Sr处理rBMSCs前2小时,10μtmol/L SB431542预处理细胞2小时,共培养21天。用单因素方差分析显示总体均数间有显著统计学差异(F=19.161,P<0.001),Sr组可明显增加钙结节的数量,与任意一组比较均有统计学意义(P<0.05),在3mM Sr处理rBMSCs前2小时,10μmol/L SB431542预处理细胞2小时能明显地抑制Sr对钙结节形成的促进作用,两组相比有统计学差异(P<0.05),对照组、SB组、DMSO组三组间无统计学差异(P>0.05)。4、Sr对rBMSCs TGF-β1蛋白表达的影响应用0、0.1、1、3、5、7mM Sr分别处理rBMSCs7天。用单因素方差分析示总体均数间有显著统计学差异(F=583.858,P<0.001),0.1-5mM Sr各组较均可显著地上调TGF-β1的表达,与对照组比较有统计学意义(P<0.05),其中当Sr浓度为1mM时,TGF-β1表达达到高峰,与各组相比有统计学差异(P<0.05),但当Sr=7mM时,Sr对TGF-β1表达无明显作用,与对照组比较,无统计学差异(P>0.05)；在1到10天的时间范围内,用1mM Sr诱导细胞。用Welch校正法可知总体均数间有统计学差异(P<0.001),各组呈时间依赖性地促进TGF-β1表达,在第7天时TGF-β1表达达到高峰,与各组相比,差异有统计学意义(P<0.01),第10天时Sr对TGF-β1的表达无明显增加,与对照组相比无统计学差异(P>0.05)；应用1mM Sr处理rBMSCs前2小时,给予10μmol/L SB431542预处理,共培养7天。用单因素方差分析示总体均数间有显著统计学差异(F=314.375,P<0.001),其中1mM Sr可明显的促进TGF-β1的表达,与其余各组比较,有显著统计学差异(P<0.01),加入SB431542后可明显地抑制Sr对TGF-β1表达的上调作用,两组相比有显著统计学差异(P<0.01),对照组、SB组、DMSO组三组间无统计学差异(P>0.05)。5、Sr对rBMSCs Runx2mRNA表达的影响应用0、1、2、5、7、10mM Sr分别处理rBMSCs7天。用单因素方差分析可知总体均数间有显著统计学差异(F=985.949,P<0.001),应用1-5mM Sr时可显著地上调Runx2mRNA的表达,其中浓度为1mM时,Runx2mRNA表达达到高峰,与对照组相比有统计学差异(P<0.01),当Sr=7和Sr=10mM时,Runx2mRNA表达均明显下降,与对照组比较有统计学差异(P<0.01)；在0.5小时-14天的时间范围内,1mM Sr培养细胞。用单因素方差分析可知总体均数间有显著统计学差异(F=353.551,P<0.001),Sr呈时间依赖性地促进Runx2mRNA表达,在第7天时Runx2mRNA表达达到高峰,与其余各组比较有显著统计学差异(P<0.01)；在应用1mM Sr处理rBMSCs前2小时,给予10μmol/L SB431542预处理,共培养7天。单因素方差分析可知总体均数间有显著统计学差异(F=5510.983,P<0.001),1mM Sr可明显的促进Runx2mRNA表达,与对照组相比(P<0.01),加入阻断剂后可明显地抑制Sr对Runx2mRNA表达的上调作用,两组比较有显著统计学差异(P<0.01),对照组、SB组、DMSO组三组间无统计学差异(P>0.05)。结论1、应用全骨髓贴壁法分离、提纯、培养rBMSCs较其它方法安全、方便；rBMSCs在应用成骨诱导液培养条件下,可向成骨细胞分化,具有成骨分化的潜能。2、Sr可较好的诱导rBMSCs分化为成骨细胞,此作用可能与其上调TGF-β1-Runx2表达有关。