论文部分内容阅读
葡萄是世界范围内种植最为广泛的经济作物之一,由植物病原卵菌Plasmopara viticola引起的葡萄霜霉病是一种世界性的古老病害,遍布国内各个葡萄产区,是葡萄主要病害之一,给葡萄生产造成严重的经济损失,是生产上重大灾害和重点防治对象。目前,生产上主要通过化学农药来防控葡萄霜霉病的发生及流行,药剂包括甲氧基丙烯酸酯类、苯基酰胺类、羧酸酰胺类等杀菌剂,但是P.viticola已经对这些农药或部分农药产生抗性或存在潜在抗性。因此,可以有效替代化学杀菌剂防控霜霉病的生防因子的筛选成为研究的热点。植物内生芽孢杆菌(Bacillus spp.)做为一种植物病害生防因子,被广泛应用于农业生产中,其通过定殖至植物根际、体表或体内,与病原菌竞争植物周围的营养及空间,分泌抗菌物质以抑制病原菌生长,诱导植物防御系统抵御病原菌入侵。本研究以本实验室前期筛选出的植物内生解淀粉芽孢杆菌EDR4为生防因子,研究其对P.viticola的抑菌作用和对葡萄霜霉病的防控效果,初步明确其对葡萄霜霉病的生防机理,得到如下主要结果:1.B.amyloliquefaciens EDR4对P.viticola有良好的抑菌效果:离体叶片和叶盘接种试验结果表明,B.amyloliquefaciens EDR4菌悬液(1×108个/mL)分别于接种P.viticola前后处理葡萄叶盘,P.viticola产孢指数为1.33和1.41,无菌滤液处理葡萄叶盘P.viticola不产孢。大田试验结果表明,B.amyloliquefaciens EDR4菌液在大田环境下对葡萄霜霉病的防控效果为70%左右,其中,施用三次后效果最优,两年防控效果分别为76.61%和70.40%,与80%烯酰吗啉防控效果相当。2.苯胺蓝染色显微观察结果表明B.amyloliquefaciens EDR4菌悬液和无菌滤液处理葡萄叶片并接种P.viticola,24h后侵染点密度分别为1.3820×104个/cm2和1.009×104个/cm2,显著小于清水对照,5d后P.viticola菌丝扩展程度显著小于清水对照2.2016×104个/cm2,7d后P.viticola未形成成熟的产孢结构,而清水对照已大量产生成熟的孢子囊。3.B.amyloliquefaciens EDR4通过诱导抗性提高葡萄对P.viticola的防御能力:葡萄叶片抗性相关酶活测定结果表明,B.amyloliquefaciens EDR4菌悬液(1×108个/mL)处理葡萄叶片后,POD、SOD和PPO活性分别在接种P.viticola 72h时达到峰值,分别为对照的4.71、1.98和2.74倍,CAT和PAL活性分别在接种P.viticola 96h和48h时达到峰值,分别为对照的4.33和6.76倍;无菌滤液处理葡萄叶片后,POD、CAT和PAL活性分别在在接种P.viticola 72h时达到峰值,分别为对照的6.79、10.95和2.32倍,SOD和PPO活性分别在接种P.viticola 96h和48h达到峰值,为对照的1.58和19.68倍。SA和JA/ET信号通路相关基因定量分析发现,EDR4菌体和无菌滤液可以不同程度诱导SA/JA信号通路相关基因上调表达,EDR4处理并接种P.viticola后,PR1、PR2、NPR1、NRX-1、LOX基因在接种后6h或12h上调表达量最大。组织学观察,发现EDR4菌体不能诱导葡萄叶片H2O2的积累,EDR4菌悬液处理并接种P.viticola可以提前至6h观察到H2O2的积累,而EDR4无菌滤液处理在12h后即可观察H2O2的积累,接种P.viticola也可以提前至6h观察到H2O2的积累。4.对B.amyloliquefaciens EDR4外泌的环脂肽类物质进行粗提,得到浓度为2.736g/L75%甲醇粗提物和0.7494g/L 95%甲醇粗提物。经过抑菌活性检测,发现75%甲醇粗提物对V.mali、C.gloeosporioides、B.cinerea等植物病原真菌具有优异的抑制效果,并对P.infestans和P.viticola等植物病原卵菌同样具有优异的抑制效果。综上所述,植物内生芽孢杆菌B.amyloliquefaciens EDR4可以有效抑制P.viticola的侵染及扩展,并有效防控葡萄霜霉病的发生,且对葡萄霜霉病的生防作用主要通过诱导抗性来实现。