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多酚是一类广泛存在于植物体内的重要次生代谢产物，由于其具有强效清除自由基的功能，不仅有助于植物抵御各种生物和非生物胁迫，而且在植物性食品中起着抗氧化胁迫、预防心血管病和癌症等重要作用。蔬菜是人体摄入多酚的主要来源，而我国普遍种植和食用的代表性叶菜类蔬菜作物一生菜体内的多酚含量不高。因此，提高生菜的多酚含量，对于协同提升生菜抗逆性和人体健康水平具有重要意义。施用氮肥是蔬菜生产中一项必需而关键的农艺措施，对蔬菜体内多酚含量也有显著的影响。以往在其它作物的研究中大多采用全生育期缺氮处理以提高其多酚含量，但是常常导致作物减产。因此，如何通过调控氮素供应方式，在保证生菜产量的前提下，提高生菜多酚含量，协调产量-品质-健康-环境之间的关系，对于高产优质蔬菜生产、增进人体健康和保护生态环境均有重要意义。虽然关于氮素营养对蔬菜体内多酚含量的影响已有不少的研究报道，但是关于短期适当降低氮素供应水平（简称限量供氮）对不同生菜基因型多酚积累及其健康效应的调控机理尚不完全清楚。本文以我国当前主栽的20个生菜(Lactuca sativaL.)基因型为材料，在筛选获得多酚高积累和低积累生菜基因型的基础上，采用植物生理生化、分子生物学、代谢组学和细胞模型试验等相结合的方法，围绕收获前短期限量供氮方式对生菜产量和多酚积累的影响及其机制、限量供氮对生菜叶片多酚代谢的影响及其调控机理、限量供氮下生菜叶片多酚组成和含量变化及其与细胞抗氧化和抗癌活性的关系等方面进行了研究。取得的主要结果如下:
1.以我国主栽的20个生菜基因型为材料，研究了正常供氮(8 mM NO3-)和低氮(1 mM NO3-)条件下生菜多酚积累对氮素水平响应的差异。结果表明，20个供试生菜基因型的多酚含量存在显著差异，其总酚和类黄酮含量分别分布在12.95-53.40 mg g-1 DW和18.45-121.14 mg g-1 DW的范围内，两者最高含量分别是最低含量的4.0倍和6.6倍;不同株型和叶色生菜基因型多酚含量差异显著，多酚含量由高到低顺序依次为散生、直立和结球生菜，红叶生菜多酚含量显著高于绿叶生菜。低氮处理可显著提高生菜多酚含量，且不同生菜基因型多酚含量对供氮水平的响应存在显著差异，如低氮条件下四季生菜的总酚含量比正常供氮对照增加了71.58％，而里瑙多生菜仅增加了10.77％。基因型和供氮水平对生菜多酚含量变异的贡献率分别约为70％和20％。不同供氮水平下生菜总抗氧化活性与多酚含量的相关性高于抗坏血酸、谷胱甘肽和类胡萝卜素。由此可见，在选育多酚高积累生菜的基础上，采用氮素营养调控方式是综合提高生菜多酚积累和抗氧化活性的有效途径。
2.以多酚高积累（紫罗马）和低积累（绿罗）生菜基因型为材料，研究了收获前短期限量供氮方式对2个生菜基因型生物量、多酚积累和抗氧化活性的影响及其机制。结果表明，收获前7d将供氮水平由8 mM NO3--N分别降低到1 mM或0.5 mM NO3--N时，紫罗马和绿罗地上部鲜重未显著降低;生菜叶片可溶态的多酚含量占到总多酚含量的96％以上，收获前7d将供氮水平降低到2 mM及以下时，可不同程度地上调生菜叶片多酚合成相关酶(PAL、CHS、F3H、DFR、F35H和UFGT)的基因表达，进而提高生菜叶片可溶态多酚含量和抗氧化活性;通过HPLC-MS分析方法在生菜中共分离鉴定出12种多酚化合物，收获前限量供氮处理可显著提高除香豆酰奎宁酸外11种可溶态多酚化合物含量;紫罗马比绿罗含有更高的多酚含量，但是绿罗在收获前限量供氮下的多酚增幅高于紫罗马。表明，收获前采用短期限量供氮可在维持生菜产量前提下，显著提高生菜叶片多酚含量和抗氧化活性，是一项能实现生菜稳产提质目标的有效氮素调控模式，但应根据不同生菜基因型对氮素营养响应的差异采用相应的限量供氮水平。
3.以20 d龄的多酚高积累生菜基因型（紫罗马）为材料，采用分子生物学和非靶向代谢组学技术相结合的方法，研究了正常供氮(2 mM NO3--N)和限量供氮(0.05 mM NO3-)处理（下同）下生菜叶片多酚代谢的变化及其与碳氮代谢的关系。结果显示，生菜叶片多酚代谢对限量供氮的响应迅速，处理1d即可显著上调生菜叶片多酚合成酶PAL、CHS、F35H和UFGT的基因表达，处理2d后生菜叶片总酚和类黄酮含量显著增加。代谢组学结果表明，限量供氮下的差异代谢物据KEGG分析主要富集到柠檬酸循环、乙醛酸和二羧酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基酸代谢和多酚代谢等通路。限量供氮显著降低柠檬酸循环中苹果酸和延胡索酸含量，但显著提高了生菜叶片蔗糖、葡萄糖和果糖含量，而对生菜叶绿素含量无显著影响。限量供氮条件下谷氨酰胺、甘氨酸和天冬氨酸等氨基酸含量显著降低，而脯氨酸、色氨酸和酪氨酸等含量却显著增加，苯丙氨酸含量无显著变化;限量供氮处理显著降低了GS活性，却显著提高GOGAT活性。表明，生菜叶片多酚代谢对限量供氮处理的响应非常迅速，且多酚代谢与初生代谢中的碳氮代谢密切相关，限量供氮下相对过剩的碳源流向多酚合成过程、维持和增加多酚合成的前体氨基酸含量是限量供氮下生菜叶片多酚积累的重要原因。
4.以20 d龄的多酚高积累生菜基因型（紫罗马）为材料，采用外源蔗糖及其合成抑制剂(DUMU)处理，研究了蔗糖对限量供氮下生菜叶片多酚代谢的调控作用及其机理。结果表明，限量供氮处理1d后生菜叶片蔗糖合成相关酶(SS和SPS)活性显著增加，而蔗糖分解相关酶(AIT和NIT)活性无显著变化，从而导致生菜叶片蔗糖含量的增加。外源喷施蔗糖可进一步增加生菜叶片蔗糖含量，上调多酚合成酶(PAL、CHS、F3H、DFR、F35H和UFGT)的基因表达，提高限量供氮下生菜叶片多酚积累，而外源DCMU处理则逆转了上述过程;外源蔗糖对限量供氮下生菜叶片多酚积累的促进效果好于葡萄糖和果糖。外源蔗糖处理对叶绿素含量、PSII最大量子产量(Fv/Fm)、实际量子产量（ΦPSII）和非调节性能量耗散量子产量(Y(NO))无显著影响，但蔗糖却显著逆转了限量供氮下由DCMU处理引起的Fv/Fm、ΦPSII和ETR下降和Y(NO)增加。此外，外源蔗糖处理可显著增加限量供氮下生菜叶片谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性，而DCMU处理则降低GS和GOGAT活性。可见，限量供氮诱导生菜叶片快速积累的蔗糖在多酚合成过程中起着重要的调控作用，并通过促进多酚合成酶的基因表达，提高生菜叶绿体光能转换和利用效率以及GS和GOGAT活性，增强多酚合成所需碳源和前体氨基酸的供给能力，从而提高限量供氮下生菜体内的多酚含量。
5.以20 d龄的多酚高积累生菜基因型（紫罗马）为材料，研究了限量供氮下生菜叶片多酚组成和含量变化及其与细胞抗氧化活性的关系。结果显示，限量供氮处理可显著提高生菜叶片多酚合成酶SKDH、PAL、C4H和4CL活性，增加生菜叶片总酚和类黄酮含量，并显著改变了其多酚组成，其中绿原酸和槲皮素占总多酚含量的比例显著上升。限量供氮下生菜叶片多酚提取物预处理可显著提高H2O2诱导下Caco-2细胞内的过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低细胞内活性氧含量，减缓由H2O2引起的线粒体膜电位下降和DNA损伤，从而提高细胞存活率。相关分析表明，细胞存活率与生菜叶片提取物中的多酚含量呈显著正相关，其中与绿原酸和槲皮素含量的相关性最高。表明，限量供氮处理可显著提高生菜叶片多酚含量尤其是绿原酸和槲皮素含量，进而提高生菜叶片多酚提取物的细胞抗氧化活性。
6.以20 d龄的多酚高积累生菜基因型（紫罗马）为材料，研究了限量供氮下生菜叶片多酚组成和含量变化及其与抑制癌细胞增殖活性的关系。结果显示，限量供氮处理可显著提高生菜叶片多酚提取物对Caco-2细胞增殖的抑制活性，且呈剂量依赖性，并导致细胞染色质固缩、线粒体膜电位下降和DNA损伤等现象发生。限量供氮下生菜叶片提取物可显著增加晚期凋亡细胞数目，下调抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL表达以及上调促凋亡因子Bax和Bad表达，并增加Caco-2细胞中处于G1期的细胞所占百分率。限量供氮处理下生菜叶片提取物中的多酚含量尤其是绿原酸和槲皮素含量显著增加，而抗Caco-2细胞增殖活性试验结果表明槲皮素在供试的纯多酚化合物中抑制癌细胞增殖活性最强。可见，限量供氮下生菜叶片多酚提取物具有较强的抑制癌细胞增殖活性与其较高的多酚含量尤其槲皮素含量有关，其主要机制是诱导了细胞周期停滞和细胞晚期凋亡的发生。
1.以我国主栽的20个生菜基因型为材料，研究了正常供氮(8 mM NO3-)和低氮(1 mM NO3-)条件下生菜多酚积累对氮素水平响应的差异。结果表明，20个供试生菜基因型的多酚含量存在显著差异，其总酚和类黄酮含量分别分布在12.95-53.40 mg g-1 DW和18.45-121.14 mg g-1 DW的范围内，两者最高含量分别是最低含量的4.0倍和6.6倍;不同株型和叶色生菜基因型多酚含量差异显著，多酚含量由高到低顺序依次为散生、直立和结球生菜，红叶生菜多酚含量显著高于绿叶生菜。低氮处理可显著提高生菜多酚含量，且不同生菜基因型多酚含量对供氮水平的响应存在显著差异，如低氮条件下四季生菜的总酚含量比正常供氮对照增加了71.58％，而里瑙多生菜仅增加了10.77％。基因型和供氮水平对生菜多酚含量变异的贡献率分别约为70％和20％。不同供氮水平下生菜总抗氧化活性与多酚含量的相关性高于抗坏血酸、谷胱甘肽和类胡萝卜素。由此可见，在选育多酚高积累生菜的基础上，采用氮素营养调控方式是综合提高生菜多酚积累和抗氧化活性的有效途径。
2.以多酚高积累（紫罗马）和低积累（绿罗）生菜基因型为材料，研究了收获前短期限量供氮方式对2个生菜基因型生物量、多酚积累和抗氧化活性的影响及其机制。结果表明，收获前7d将供氮水平由8 mM NO3--N分别降低到1 mM或0.5 mM NO3--N时，紫罗马和绿罗地上部鲜重未显著降低;生菜叶片可溶态的多酚含量占到总多酚含量的96％以上，收获前7d将供氮水平降低到2 mM及以下时，可不同程度地上调生菜叶片多酚合成相关酶(PAL、CHS、F3H、DFR、F35H和UFGT)的基因表达，进而提高生菜叶片可溶态多酚含量和抗氧化活性;通过HPLC-MS分析方法在生菜中共分离鉴定出12种多酚化合物，收获前限量供氮处理可显著提高除香豆酰奎宁酸外11种可溶态多酚化合物含量;紫罗马比绿罗含有更高的多酚含量，但是绿罗在收获前限量供氮下的多酚增幅高于紫罗马。表明，收获前采用短期限量供氮可在维持生菜产量前提下，显著提高生菜叶片多酚含量和抗氧化活性，是一项能实现生菜稳产提质目标的有效氮素调控模式，但应根据不同生菜基因型对氮素营养响应的差异采用相应的限量供氮水平。
3.以20 d龄的多酚高积累生菜基因型（紫罗马）为材料，采用分子生物学和非靶向代谢组学技术相结合的方法，研究了正常供氮(2 mM NO3--N)和限量供氮(0.05 mM NO3-)处理（下同）下生菜叶片多酚代谢的变化及其与碳氮代谢的关系。结果显示，生菜叶片多酚代谢对限量供氮的响应迅速，处理1d即可显著上调生菜叶片多酚合成酶PAL、CHS、F35H和UFGT的基因表达，处理2d后生菜叶片总酚和类黄酮含量显著增加。代谢组学结果表明，限量供氮下的差异代谢物据KEGG分析主要富集到柠檬酸循环、乙醛酸和二羧酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基酸代谢和多酚代谢等通路。限量供氮显著降低柠檬酸循环中苹果酸和延胡索酸含量，但显著提高了生菜叶片蔗糖、葡萄糖和果糖含量，而对生菜叶绿素含量无显著影响。限量供氮条件下谷氨酰胺、甘氨酸和天冬氨酸等氨基酸含量显著降低，而脯氨酸、色氨酸和酪氨酸等含量却显著增加，苯丙氨酸含量无显著变化;限量供氮处理显著降低了GS活性，却显著提高GOGAT活性。表明，生菜叶片多酚代谢对限量供氮处理的响应非常迅速，且多酚代谢与初生代谢中的碳氮代谢密切相关，限量供氮下相对过剩的碳源流向多酚合成过程、维持和增加多酚合成的前体氨基酸含量是限量供氮下生菜叶片多酚积累的重要原因。
4.以20 d龄的多酚高积累生菜基因型（紫罗马）为材料，采用外源蔗糖及其合成抑制剂(DUMU)处理，研究了蔗糖对限量供氮下生菜叶片多酚代谢的调控作用及其机理。结果表明，限量供氮处理1d后生菜叶片蔗糖合成相关酶(SS和SPS)活性显著增加，而蔗糖分解相关酶(AIT和NIT)活性无显著变化，从而导致生菜叶片蔗糖含量的增加。外源喷施蔗糖可进一步增加生菜叶片蔗糖含量，上调多酚合成酶(PAL、CHS、F3H、DFR、F35H和UFGT)的基因表达，提高限量供氮下生菜叶片多酚积累，而外源DCMU处理则逆转了上述过程;外源蔗糖对限量供氮下生菜叶片多酚积累的促进效果好于葡萄糖和果糖。外源蔗糖处理对叶绿素含量、PSII最大量子产量(Fv/Fm)、实际量子产量（ΦPSII）和非调节性能量耗散量子产量(Y(NO))无显著影响，但蔗糖却显著逆转了限量供氮下由DCMU处理引起的Fv/Fm、ΦPSII和ETR下降和Y(NO)增加。此外，外源蔗糖处理可显著增加限量供氮下生菜叶片谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性，而DCMU处理则降低GS和GOGAT活性。可见，限量供氮诱导生菜叶片快速积累的蔗糖在多酚合成过程中起着重要的调控作用，并通过促进多酚合成酶的基因表达，提高生菜叶绿体光能转换和利用效率以及GS和GOGAT活性，增强多酚合成所需碳源和前体氨基酸的供给能力，从而提高限量供氮下生菜体内的多酚含量。
5.以20 d龄的多酚高积累生菜基因型（紫罗马）为材料，研究了限量供氮下生菜叶片多酚组成和含量变化及其与细胞抗氧化活性的关系。结果显示，限量供氮处理可显著提高生菜叶片多酚合成酶SKDH、PAL、C4H和4CL活性，增加生菜叶片总酚和类黄酮含量，并显著改变了其多酚组成，其中绿原酸和槲皮素占总多酚含量的比例显著上升。限量供氮下生菜叶片多酚提取物预处理可显著提高H2O2诱导下Caco-2细胞内的过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低细胞内活性氧含量，减缓由H2O2引起的线粒体膜电位下降和DNA损伤，从而提高细胞存活率。相关分析表明，细胞存活率与生菜叶片提取物中的多酚含量呈显著正相关，其中与绿原酸和槲皮素含量的相关性最高。表明，限量供氮处理可显著提高生菜叶片多酚含量尤其是绿原酸和槲皮素含量，进而提高生菜叶片多酚提取物的细胞抗氧化活性。
6.以20 d龄的多酚高积累生菜基因型（紫罗马）为材料，研究了限量供氮下生菜叶片多酚组成和含量变化及其与抑制癌细胞增殖活性的关系。结果显示，限量供氮处理可显著提高生菜叶片多酚提取物对Caco-2细胞增殖的抑制活性，且呈剂量依赖性，并导致细胞染色质固缩、线粒体膜电位下降和DNA损伤等现象发生。限量供氮下生菜叶片提取物可显著增加晚期凋亡细胞数目，下调抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL表达以及上调促凋亡因子Bax和Bad表达，并增加Caco-2细胞中处于G1期的细胞所占百分率。限量供氮处理下生菜叶片提取物中的多酚含量尤其是绿原酸和槲皮素含量显著增加，而抗Caco-2细胞增殖活性试验结果表明槲皮素在供试的纯多酚化合物中抑制癌细胞增殖活性最强。可见，限量供氮下生菜叶片多酚提取物具有较强的抑制癌细胞增殖活性与其较高的多酚含量尤其槲皮素含量有关，其主要机制是诱导了细胞周期停滞和细胞晚期凋亡的发生。