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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重危害全球养猪业的传染病。PRRSV的核衣壳(N)蛋白是表达丰度最高的病毒蛋白,与病毒基因组RNA组装形成核衣壳,同时能够影响多种细胞蛋白的功能。分析PRRSV感染的宿主差异表达蛋白有助于理解病毒感染导致的机体代谢变化及病毒的致病机制,分析N蛋白与细胞蛋白之间的相互作用有助于理解PRRSV感染过程中N蛋白发挥的作用。本论文重点探究了PRRSV N蛋白与细胞蛋白DHX9之间以及N蛋白与病毒RdRp之间的相互作用,并探讨了细胞PARP-1、DHX9及病毒Rd Rp与N蛋白的相互作用对病毒增殖的影响。论文的主要研究内容及结果如下:1.采用定量质谱技术鉴定PRRSV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)与未感染的健康细胞得到39个差异表达蛋白。生物信息学分析的结果显示,PRRSV感染后宿主的IL1β和IL8表达上调可能是导致细胞出现病理性变化的重要因素,而且病毒可借助不同细胞蛋白的上调或下调表达来逃避宿主的天然免疫。进一步分析通过定量质谱鉴定得到的PRRSV N蛋白互作组的108个细胞蛋白,发现N蛋白与细胞的蛋白翻译系统和RNA转录加工系统有密切联系。2.通过小分子抑制剂3-AB抑制与N蛋白互作的细胞蛋白PARP-1的功能,证实PARP-1对病毒的滴度、感染率、RNA及蛋白合成过程有重要影响。经药物敏感性测试发现,PRRSV在抑制剂的选择压力下连续传代15次,未产生抗3-AB的突变病毒。这些结果表明,分析利用N蛋白的细胞蛋白互作组是鉴定影响病毒增殖的关键细胞蛋白的一条有效途径。3.通过免疫共沉淀(coIP)技术和荧光显微镜观察证实了PRRSV N蛋白与细胞RNA解旋酶DHX9的相互作用。通过免疫荧光技术观察到过量表达N蛋白及PRRSV感染的细胞中内源性DHX9都由细胞核重新定位到细胞质中。通过干扰DHX9基因的表达发现病毒基因组RNA(gRNA)和长链亚基因组RNA(sgRNA)的合成受到抑制;而过量表达DHX9蛋白则促进gRNA和长链sgRNA的合成。表明细胞蛋白DHX9受病毒N蛋白招募由细胞核迁移到细胞质中以促进病毒长链RNA的合成。4.我们发现并在不同PRRSV毒株中证实N蛋白能够与病毒非结构蛋白9(NSP9)发生相互作用。NSP9是病毒编码的RNA依赖的RNA聚合酶(Rd Rp)。我们鉴定出PRRSV NSP9与N蛋白结合的结构域位于其C末端599-646位氨基酸区域内,并且通过定点突变确定了NSP9上的E646、E608和E611以及N蛋白上的Q85是两者结合的关键氨基酸。通过在感染的细胞内过量表达与N蛋白结合的NSP9截短片段来竞争性抑制蛋白间的互作,发现病毒的总RNA及gRNA合成都受到抑制;表达关键氨基酸突变的NSP9片段的抑制效果减弱。表明N蛋白与NSP9的相互作用可能参与了病毒RNA复制转录的调节过程。综上所述,我们通过高通量蛋白组学的方法分析了与PRRSV致病相关的宿主细胞蛋白;发现PRRSV N蛋白主要与RNA加工及蛋白翻译过程相关的细胞蛋白相互作用;发现PAPR-1对PRRSV的生物学过程有重要影响;同时证实细胞蛋白DHX9与病毒N蛋白相互作用能够促进病毒增殖。值得注意的是,我们发现PRRSV N蛋白能够与病毒的RdRp相互作用并促进病毒RNA的合成。本论文为深入研究PRRSV感染过程中N蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的生物学意义及阐明病毒负链RNA合成的分子机制提供了依据。