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目的：GluR5-KAR在多种神经性疾病(比如中风、多发性硬化以及多种神经退行性疾病)中发挥着重要作用。巯基亚硝基化类似于磷酸化和酰基化,在生物系统中,包括神经递质的释放、神经毒性和细胞凋亡方面,具有广泛的作用。但是,对于GluR5-KAR的巯基巯基亚硝基化尚未见报道。本文旨在研究GluR5激动剂ATPPA引起其巯基巯基亚硝基化的机制和作用。
方法：转染GluR5-2a或其突变体的HEK293细胞被用来检测GluR5-KA巯基亚硝基化和鉴定其承担巯基亚硝基化的关键半胱氨酸。QuikChange kit被用来制备GluR5-2a的突变体。混合培养的原代海马神经元被用来揭示GluR5-KA巯基亚硝基化的主要机制,电生理记录被用来记录GluR5介导的全细胞电流记录。DAPI染色被用来显示带有聚集浓缩或者碎片细胞核的凋亡细胞。
结果：
1、HEK293细胞表达的重组体GluR5-2a能被亚硝化,C231和C804承担关键作用。
2、转染了GluR5、PSD-95和nNOS或者GluR5和nNOS的HEK293细胞免疫沉淀证明GluR5可通过PSD-95介导组装成信号模块GIuR5·PSD-95·nNOS。
3、ATPA刺激可以诱导原代培养的海马神经元中GluR5-KA的巯基亚硝基化,但其程度要远低于NMDA刺激引起的GluR5巯基亚硝基化。
4、ATPA刺激引起原代培养的海马神经元中GluR5-KA巯基亚硝基化主要是通过GluR5-KA-Gq-PLC-IP3R信号通路和nNOS激活介导的。
5、GluR5-KA巯基亚硝基化抑制了ATPA刺激诱导的GluR5-KAR介导的全细胞电流6、nNOS抑制剂7NI、PLC抑制剂U-73122、IP3R抑制剂2-APB和胞内Ca2+螯合剂BAPTA对ATPA刺激诱导的原代海马神经元的凋亡具有明显的保护作用。
结论：ATPA刺激诱导的GluR5-KAR导的全细胞电流的衰减。A巯基亚硝基化激活了非经典的GluR5-KA-Gq-PLC-IP3R信号通路,导致胞内钙库内质网中大量Ca2+释放到胞浆中,大量的Ca2+进一步导致了nNOS的激活,最终使得GluR5发生巯基亚硝基化,抑制了ATPA刺激诱导的GluR5-KAR介导的全细胞电流的衰减,诱导了混合培养的原代海马神经元的凋亡。抑制GluR5-KAR巯基亚硝基化的药物7NI、U-73122、2-APB和BAPTA对此具有明显保护作用。