本文的研究工作主要围绕重组溶瘤病毒(重组单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型)在诊断和治疗方面的应用研究，实验涉及分子克隆、细胞培养、实验动物荷瘤及治疗、病毒的生产纯化等技术。发现带有GM-CSF的HSV病毒与化疗药物联合应用治疗肿瘤没有协同作用；带有绿色荧光蛋白(GFP)的HSV病毒在检测循环肿瘤细胞(CTC)方面具有一定的精度，这种用HSVGFP检测病人体内隐性播散肿瘤细胞的方法简便且具有较高的敏感性。　　 一、溶瘤病毒联合奥沙利铂治疗小鼠黑色素瘤　　 目的：用鼠B16-R黑色素瘤动物模型对溶瘤性Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV2-GMCSF)联合奥沙利铂的治疗效果和安全性进行评估。　　 方法：B16-R黑色素瘤细胞在C57小鼠中诱导产生肿瘤，分成对照组，单独使用HSV2-GMCSF治疗组，单独使用奥沙利铂组和HSV2-GMCSF联合奥沙利铂治疗组。　　 结果：对照组肿瘤呈指数生长，治疗组肿瘤直径明显小于对照组。其中，HSV2-GMCSF单独治疗组的治疗效果最好，其次是HSV2-GMCSF联合奥沙利铂单独治疗组。　　 结论：虽然单独使用HSV2-GMCSF治疗组、HSV2-GMCSF联合DTIC治疗组与对照组相比显示出明显的抑瘤效果，但上述两者之间的抑瘤效果差别并不是很明显。病毒在肿瘤细胞中的复制会使肿瘤组织坏死，妨碍化疗药物到达肿瘤部位；而化疗药物对机体的免疫系统可能存在抑制作用，从而降低溶瘤病毒所激发的机体抗肿瘤免疫反应，所以合适的给药顺序和配伍方案非常重要，此次研究中采用的是溶瘤病毒和化疗药物同时期给药的顺序。还需要进一步探索，选出更好的配伍方案和给药顺序。　　 二、用表达绿色荧光蛋白的单纯疱疹病毒HSVGFP快速检测隐性播散肿瘤细胞　　 目的：用表达绿色荧光蛋白的单纯疱疹病毒--HSVGFP建立一种快速检测隐性播散肿瘤细胞的方法，并检测70例临床样本。　　 方法：肿瘤细胞回收方法的建立：即Ficoll离心收集肿瘤细胞的方法。以外周血为例预实验方法：将人源肿瘤细胞加入到全血当中，肿瘤细胞的个数设计为0、10、100、1000、10000五个梯度，用Ficoll分离淋巴细胞层联合用红细胞裂解液裂解红细胞，用HSVGFP感染收集到的细胞，37℃孵育6～24 h，然后用荧光显微镜进行观察。临床样本检测方法：收集临床样本(外周血3 mL、胸水或腹水50 mL、脊髓0.5 mL、)，用Ficoll分离淋巴细胞层联合用红细胞裂解液裂解红细胞，用HSVGFP感染收集到的细胞，37℃孵育6～24 h，然后用荧光显微镜进行观察。按照所观察到荧光数目的多少，用以下符号进行记录：“-”未检测到荧光细胞；“+”1-10个荧光细胞；“++”11-20个荧光细胞；“+++”>20个荧光细胞。　　 结果：此方法可以在6.25×105的淋巴细胞中检测出10个肿瘤细胞。70例临床样本中有40例呈阳性。　　 结论：实验结果证明，这种用HSVGFP检测病人体内隐性播散肿瘤细胞的方法简便且具有较高的敏感性。　　 三、溶瘤病毒HSV2-GMCSF的生产纯化　　 目的：摸索生产纯化HSV2-GMCSF的条件.　　 方法：通过测量病毒滴度，筛选出最佳收获时间、最佳盐裂解浓度、病毒在37℃下稳定性、病毒在不同pH值下的稳定性。分别用滚瓶、生物反应器生产病毒，高速离心和分子筛纯化病毒。　　 结果：滚瓶培养可以使达到的病毒最高滴度为：HSV1-GMCSF(2.3×108PFU/mL)，HSV1-GFP(4×107 PFU/mL)，HSV2-GMCSF(6.6×107 PFU/mL)，HSV2-GFP(2.3×107 PFU/mL)，每个滚瓶可以收获病毒液30 mL。生物反应器生产HSV2-GMCSF的滴度为4.2×10s PFU/mL，每罐可收获2.5 L。通过低速离心去除细胞碎片，高速离心收集病毒的方法可以收获约1/2的病毒。由于实验条件有限，先冻融，后分子筛分离的病毒滴度很低，未达到预期效果，需要进一步完善实验设备。在滚瓶中生产时最佳收获时间为88 h；最佳裂解液浓度为1M或1.2 M；只裂解不冻融的收获方式会得到更高的病毒滴度：病毒在pH6.64～7.38的环境中常温保存6h，未见滴度明显下降；病毒在37℃环境中的半衰时间约为16 h。　　 结论：在现今条件下，滚瓶培养是生产病毒的较佳选择。