论文部分内容阅读
急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是临床常见的急危重症,全球年发病率约13-45/10万,近年来AP综合治疗取得了较大进展,然而重症急性胰腺炎（sereve acute pancreatitis,SAP）患者病死率仍然高达17%-39%。AP患者临床死亡存在两个高峰,即早期全身性炎症反应（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）导致的多脏器功能障碍综合症（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）和后期的胰腺及胰周坏死组织感染所致的脓毒症休克、MODS、腹腔大出血等。近年来,胆道系统及胆汁酸在危重患者炎症反应中的作用逐步引起重视,研究发现,胆汁外引流可减轻脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的脓毒症大鼠肠道损伤,此外,胆总管置管外引流可减轻牛磺胆酸钠胆管逆行注射诱导的SAP大鼠早期炎症反应、保护脏器功能。在临床工作中,一些胆源性SAP患者发病早期存在胆道瘀滞或梗阻,胆道引流后病情明显改善。然而,我们发现一些非胆源性SAP患者,在病程早期也存在胆囊胆汁淤积（参照Rome III诊断标准）,给予经皮经肝胆囊穿刺外引流（percutaneous transhepatic gallbladder drainage,PTGD）可明显改善炎症反应。从而引发了我们的思考:胆囊外引流是否具备普遍的改善SAP早期过度炎症反应的作用?其机理如何?我们分四个部分进行研究:第一部分,我们以发病早期（发病＜14天）并发胆囊胆汁淤积的非胆源性SAP患者为研究对象,探讨PTGD对患者炎症反应的影响。回顾性纳入PTGD治疗患者50人,全部患者在PTGD前24h内均有发热,平均体温38.6±0.7℃,PTGD 24小时后体温明显下降（37.9±0.8 VS.38.6±0.7℃,p=0.01）,与PTGD前24h相比,PTGD 24小时后外周血白细胞计数显著降低（15.0±7.7 VS.11.6±5.3,p=0.048）,C反应蛋白在PTGD后7天已显著低于穿刺前24小时（115.9±79.3 VS.162.4±65.1,p=0.016）,SIRS评分在PTGD后第7天低于穿刺前24小时内评分（6.9±3.4 VS.9.1±2.2 p=0.038）。以上结果提示:PTGD减轻了非胆源性SAP早期并发胆囊胆汁淤积患者的炎症反应。第二部分,以仓鼠为模式动物,应用雨蛙素联合LPS建立仓鼠SAP模型（雨蛙素,50ug/kg,间隔1小时,累计4针,第4针雨蛙素后1小时,给予LPS 5mg/kg腹腔注射1次）,观察胆囊穿刺外引流对SAP仓鼠的保护作用。结果显示:SAP仓鼠胆囊较正常仓鼠胆囊明显增大、胆汁淤积。胆囊穿刺外引流后,SAP仓鼠血清淀粉酶、胰腺炎症因子水平（TNF-α、IL-1β）、胰腺病理损伤及相关肺损伤均显著好转,提示胆囊外引流可显著改善SAP仓鼠胰腺病理损伤、保护远隔脏器功能。第三部分,在上述研究基础上,我们应用0.5%的人胆汁（源自胰腺肿瘤术前胆道置管引流超过一周的胆汁（接近正常人群胆汁,后称为正常胆汁）和第一部分临床研究中经PTGD获得的SAP患者胆汁）孵育腺泡细胞（原代胰腺腺泡细胞及266-6腺泡细胞株）,观察不同来源胆汁对胰腺腺泡细胞的毒性作用。结果显示,与正常胆汁相比,SAP患者胆汁孵育后的两种腺泡细胞LDH释放显著增加,细胞活性显著下降。同时,细胞坏死通路RIP3及p-MLKL通路表达显著升高,上述结果提示SAP患者胆汁具有明确的腺泡细胞毒性,可加剧腺泡细胞坏死。第四部分,为初步探讨胆汁对腺泡细胞损伤的作用途径,我们应用了一种胆汁酸G蛋白偶联受体（Takeda G-protein coupled receptor clone 5,TGR5）激动剂INT-777干预小鼠急性胰腺炎模型进行研究。首先通过蛋白质免疫印迹法检测了雨蛙素诱导AP小鼠胰腺腺泡细胞TGR5的表达水平,发现TGR5在正常胰腺组织中轻度表达,而在雨蛙素诱导的AP小鼠胰腺组织中高表达。实验小鼠分成3组,对照组,AP组和AP+INT-777组。与AP组相比,INT-777减轻了AP小鼠血清酶学和胰腺病理损伤,并降低小鼠血浆炎症因子水平（TNF-α、IL-6和IL-1β）。同时,INT-777下调了胰腺组织坏死通路关键蛋白（RIP3和p-MLKL）表达。此外,通过DHE染色,我们观察到INT-777降低了胰腺组织活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平且抑制了NLRP3炎症小体活化。上述结果提示INT-777可能通过抑制ROS/NLRP3炎症小体活化通路保护了腺泡细胞坏死、降低了AP严重程度。综上所述,本研究结果首次从临床和基础实验明确胆囊外引流可改善SAP早期过度炎症反应,考虑与胆汁（胆汁酸）参与了胰腺腺泡细胞损伤相关。本研究在一定程度上补充了对SAP早期过度炎症反应发生发展的病理生理学过程的认知,并为SAP早期治疗提供了新思路。