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聚酯纤维,商品名称涤纶（Poly ethylene terephthalate,PET纤维）,具有弹性好、耐磨性好、强度高、抗褶皱以及干燥快等优点,是纺织工业中产量增长最快的合成纤维之一。PET纤维是由对苯二甲酸和乙二醇脱水聚合形成的聚酯材料,疏水性强,不易染色,严重影响了其纺织品的品质。利用Thermobifida fusca来源的角质酶可水解PET纤维中的酯键,产生亲水性的-COOH和-OH基团以提高其亲水性。然而因PET高度结晶,降低了角质酶对PET纤维中聚酯链的可及性,严重影响角质酶的催化效率。因此,可选用接近或高于PET的玻璃态转变温度（69-80℃）进行酶处理。而T.fusca角质酶在该温度条件下热稳定性差,需通过分子改造提高其热稳定性,以满足应用需求。本研究以质粒pET-20b（+）-cut为模板,以定点突变的方式获得了一株热稳定性和pH稳定性显著提高且其他优良性状均保持不变的突变体D204C/E253C,并通过突变优化、共表达、无信号肽等方式实现了突变体D204C/E253C的高效可溶性表达。和野生型T.fusca角质酶相比,选用突变体D204C/E253C在80℃条件下对PET纤维进行亲水改性,效果提升显著。主要研究结果如下:（1）二硫键理性设计提高T.fusca角质酶热稳定性:以质粒pET-20b（+）-cut为模板,通过理性设计,以定点突变的方式引入二硫键,获得11株突变体。对突变体的热稳定性研究表明,突变体D204C/E253C的热稳定性显著提高,相比于野生型T.fusca角质酶在70℃保温10 min后仅残留10.7%的活性,突变体D204C/E253C在此条件下酶活未有下降,在80℃的半衰期可达16 h,即使在90℃保温10 min,仍具有55.6%的活性。纯化野生型T.fusca角质酶和突变体D204C/E253C,比较了两者的酶学性质,结果表明,突变体D204C/E253C除热稳定增强之外,pH稳定性也显著提升。（2）突变体D204C/E253C的高效可溶性表达:（a）在pET-20b（+）-D204C/E253C的基础上进行优化突变,酶活提升3.89倍,是E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）-cut的62.5%;（b）以构建重组菌E.coli Origami B（DE3）/pSCDsbC-D204C/E253C的方式,将突变体D204C/E253C与二硫键异构酶Dsb C在大肠杆菌trxB/gor突变株E.coli Origami B（DE3）中的共表达,从而使突变体D204C/E253C能够进行正常的可溶性表达,胞外酶活达61 U·mL-1,是E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）-cut的1.09倍;（c）构建重组菌E.coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-D204C/E253C,除去角质酶表达时的信号肽,显著提高了其可溶性表达,胞外酶活达192 U·mL-1,是E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）-cut的3.43倍;延长诱导时间至48 h时,胞外酶活可达351 U·mL-1,是E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）-cut的6.26倍。（3）突变体D204C/E253C发酵制备及在PET纤维亲水改性中的应用:将突变体D204C/E253C进行3-L罐高密度发酵,全细胞酶活最高可达1449 U?mL-1。突变体D204C/E253C在80℃条件下处理后的PET纤维,其润湿性显著提高,润湿时间降为6.3 s,比野生型T.fusca角质酶在50℃条件下处理后的PET纤维提高了1.62倍。进一步进行SEM分析显示,突变体D204C/E253C在80℃条件下处理的PET纤维表面蚀刻痕迹比野生型T.fusca角质酶在50℃条件下处理的更多,更加明显。