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番茄斑萎病毒属(Tospovirus)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)中唯一侵染植物的病毒属,番茄斑萎病毒(Tomato spotoed wilt virus,TSWV)是番茄斑萎病毒属中的重要成员。其基因组为负单链RNA(-ssRNA),分别为S、M和LRNA,其中MRNA编码移动蛋白NSm。NSm能够激活抗性基因Sw-5b介导的抗性,从而被确定为病毒的无毒因子。单显性基因Sw-5b对番茄斑萎病毒属病毒具有广谱抗性,它通过识别NSm来诱导过敏性坏死反应(Hypersensitive response,HR)从而防止病毒入侵。Sw-5b属于CC-NB-LRR类型的免疫受体蛋白,包括四个主要结构域:N端结构域(NTD)、CC结构域、NB-ARC结构域和C末端的LRR结构域。本课题组的前期研究表明Sw-5b的NB-LRR结构域可以特异性识别TSWV NSm蛋白而诱导HR反应。为确定Sw-5b NB-LRR结构域中与NSm识别的重要区段,本研究将不能识别TSWV NSm并诱导HR的感病番茄Heinz0176的Sw-5b NB-LRR与抗性番茄Sw-5b NB-LRR的相应结构域进行逐一替换,发现将Heinz0176 Sw-5b的LRR交换到抗性番茄的Sw-5bNB-LRR后不能与NSm产生HR反应,而将抗性番茄的Sw-5b的LRR交换到Heinz0176 Sw-5b NB-LRR后却能与NSm产生HR反应,说明LRR结构域是Sw-5b NB-LRR与NSm识别的重要区段。将两种NB-LRR的氨基酸序列进行比对后发现二者相似性高达93.75%,其中LRR区域的相似性最低。为进一步鉴定Sw-5b NB-LRR与NSm识别的关键氨基酸,依次将Heinz0176 LRR中的差异氨基酸位点交换到抗性番茄Sw-5b NB-LRR的中,将这些突变体与NSm在本氏烟中共表达,发现其中的两个突变体不再与NSm产生HR反应,还有两个突变体与NSm产生的HR反应强度减弱。对这四个突变体的蛋白表达水平进行检测后发现,它们的表达水平与Sw-5bNB-LRR相近,排除了因蛋白不表达或表达水平很低而导致不产生HR或HR反应强度减弱的可能性。以上结果说明,这四个位点可能是Sw-5b与TSWV NSm发生识别的位点。番茄和TSWV均起源于南美,Sw-5b可能是番茄在TSWV这一选择压的作用下不断发生进化的结果。为从进化角度上探究Sw-5b与NSm的识别机制,本研究扩增了 17种南美野生番茄Sw-5b基因的编码序列,然后分别将它们克隆到表达载体并与NSm 一起共浸润本氏烟,以检测它们能否与NSm识别而产生HR反应。综合分析各种野生番茄NB-LRR结构域的氨基酸序列和HR反应的结果后发现,当且仅当本文鉴定出的四个识别位点全部存在时,NB-LRR才能识别NSm产生HR反应。表明这四个氨基酸位点对Sw-5bNB-LRR与NSm识别确实很重要。这一结果为进一步研究Sw-5b的分子进化及其与NSm的识别机制奠定了基础。