肌腱组织的深低温保存研究

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前言: 选用新型冷冻保护试剂配方(CryoprotectiveAgent CPA)对肌腱组织进行玻璃化冷冻保存研究,考察不同冷冻保存方法对肌腱细胞细胞形态、组织结构及生物力学性能影响的影响,研究不同时段自体及异体移植肌腱大体及组织形态学差异,探讨玻璃化冷冻保存肌腱作为异体移植材料的可行性。 方法: 1、按预试验筛选出来的玻璃化保护剂保存肌腱,在液氮中保存2周以上,做为玻璃化组。“两步法”深低温冷冻保存肌腱,程控降温仪控制逐步降温致-50℃,维持40分钟后投入液氮,冷冻保存2周以上,做为”两步法”深低温组,新鲜肌腱取材后4小时内完成体外检测,做为新鲜肌腱组。电镜观察不同组间肌腱组织形态学差异,Instron-5865力学材料试验机测试不同组间肌腱生物力学差异。 2、术后2周、4周、8周无菌条件下取出植入的玻璃化保存肌腱,行HE染色及MSSON三色染色,观察肌腱愈合情况,并与相对应的不同移植时期自体肌腱及“两步法”深低温冷冻保存肌腱进行比较。 结果: 1、电镜观察结果显示:玻璃化保存法对肌腱细胞和胶原纤维结构损伤轻微,而“两步法”深低温冷冻保存法则对肌腱细胞和胶原纤维结构损伤较重,尤其以肌腱细胞为重; 2、生物力学检测结果显示:肌腱破坏荷载峰值:新鲜肌腱组与玻璃化保存组及”两步法”深低温冷冻保存组均有显著差异(F=9.222,p=0.002),玻璃化保存组与”两步法”深低温冷冻保存组无显著差异(p=0.256);最大载荷拉伸位移:新鲜肌腱组与玻璃化保存组及”两步法”深低温冷冻保存组三组间均无显著差异(F=3.288,p=0.065);杨氏弹性模量:新鲜肌腱组与玻璃化保存组及“两步法”深低温冷冻保存组均有显著差异(F=7.368,p=0.006),玻璃化保存组与”两步法"深低温冷冻保存组无显著性差异(p=0.577)。 3、不同时段肌腱移植试验结果显示:新鲜自体肌腱移植后2周时,肌腱细胞明显减少,吻合口部可见炎症细胞浸润,吻合口内有较多血管长入,4周时肌腱细胞基本消失,粗大胶原被细胶原取代,细胶原纤维趋向于连接成束,吻合口部粘连较重,8周时部分细胶原纤维连结成束,由四周向中心逐渐替代细胶原纤维,移植肌腱内血管逐渐减少消失,新的纤维排列稍欠规整。玻璃化异体肌腱吻合口部的愈合与胶原的替代进程较慢,局部粘连也稍重,替代后的胶原纤维排列也较自体组欠规整。“两步法”深低温冷冻肌腱的替代过程较新鲜肌腱组与玻璃化组更慢,局部粘连也更重,替代后的胶原结构也更差。通过三组肌腱移植后愈合进程的动态观察,可以看出新鲜自体肌腱移植效果优于玻璃化异体肌腱,而玻璃化异体肌腱又优于”两步法”深低温冷冻异体肌腱。 结论: 玻璃化法保存的肌腱具有良好的细胞结构和组织形态,体外检测力学性能结果显示,玻璃化法保存的肌腱比正常肌腱稍差,比“两步法”深低温保存肌腱稍好,但无统计学意义。将自体肌腱、玻璃化保存肌腱、“两步法”深低温冷冻保存肌腱进行体内移植,发现自体肌腱、玻璃化肌腱与“两步法”深低温保存肌腱均存在不同程度炎症反应,但不影响肌腱的愈合与重建,玻璃化法可以较好的保存肌腱组织性能,自体肌腱、玻璃化肌腱其总体效果优于“两步法”深低温保存肌腱。本项研究对今后异体肌腱的临床应用和组织库的建立具有一定参考价值。
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