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草地早熟禾(Poa pratensis L.)是一种冷季型的多年生草坪草,属于禾本科早熟禾属。因其色泽喜人和具有强抗寒性、耐修剪、耐践踏等优点应用广泛。叶绿素酶是参与叶绿降解过程中的关键酶,但有关草地早熟禾叶绿素酶1基因特性及其在叶绿素降解过程中发挥的作用鲜有报道。本研究利用RACE技术获得PpCHL1基因的全长cDNA,编码具有316个氨基酸,且含有以丝氨酸为活性中心的酯酶结构域。氨基酸序列Blast 比对结果显示与乌拉尔图小麦CHL1蛋白同源性高达74%,故而命名为PpCHL1,并在Genbank中提交登记(KU145126)。通过染色体步移技术获得PpCHL1基因的启动子序列1247bp,顺式作用元件预测发现该基因具有TATA-box(核心转录起始元件)、Box4(光响应作用元件)、AuxRR-core(响应IAA作用元件)、CCGTCC-box(植物分生组织激活位点)、CGTCA-motif、TGACG-motif(响应MeJA作用元件)、circadian(参与生理调控元件)。说明该基因响应激素信号的调节,并参与生理代谢反应。为了探讨适合草地早熟禾的内参基因,为后续进行基因表达模式分析奠定基础,本研究筛选了 6个传统内参基因(ACT、EF-1α、GAPDH、β-tublin、18s rRNA和UBQ)在草地早熟禾不同条件下的稳定性。结果表明,GAPDH最适合作草地早熟禾不同组织器官的内参基因;β-tublin最适合作不同激素诱导下的内参基因;EF-1α最适合作非生物胁迫下的校正基因;ACT最适合作叶片不同发育时期的内参基因。在启动子顺式作用元件预测的基础上,利用筛选出的适宜内参基因,本研究分析了PpCHL1基因在不同条件下的表达模式。结果表明,PpCHL1基因有明显的组织特异性,在老叶中表达量最高;该基因对ABA、SA、GA、IAA和MeJA均有响应,且对GA和IAA响应显著且持久:黑暗条件下,PpCHL1基因在胁迫中期表达量最高。因此,PpCHL1基因能感知和传递环境刺激信号,并参与叶绿素降解。为了进一步探究PpCHL1基因的功能,构建表达载体3302Y-PpCHL1,利用瞬时转化法注射本生烟草叶片,激光共聚焦显微镜观察结果显示草地早熟禾CHL1蛋白定位于细胞核与细胞质中。其次,将3302Y-PpCHL1转化拟南芥,经草铵膦抗性筛选,得到转化的再生苗。提取再生植株叶片中的DNA和RNA,进行PCR检测,部分结果为阳性,初步证实所得再生植株是转基因植株。通过测量野生型和转PpCHL1基因拟南芥植株中叶绿素含量和叶绿素酶活性,证明PpCHL1在拟南芥中稳定表达。综上所述,我们推测草地早熟禾PpCHL1基因很可能在叶绿素降解过程中感知环境变化,进而调控叶绿素降解。