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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的,主要症状以呕吐、腹泻和脱水为主的急性肠道传染病。各年龄猪均可感染PEDV,但主要在仔猪中有较高的死亡率。近年来,PEDV的不断变异给PED的防控带来了许多问题。本研究围绕PEDV的分子流行病学和新出现的S1基因N端区域大片段缺失毒株展开研究,分析了PEDV的遗传变异特征、建立了鉴别检测PEDV经典株和变异株的双重TaqMan RT-qPCR方法并探究了PEDV S1蛋白N端区域的致病机制,取得了以下结果:1.检测了从2014年7月至2015年7月收集的129份来自中国中部地区17个城市的仔猪腹泻样本。基于S糖蛋白[Spike,1-789个氨基酸(aa)]的S1亚基和ORF3基因,我们对来自11个城市21个猪场的21个代表性PEDV毒株进行了遗传变异分析。通过RT-PCR方法进行PEDV的检测,通过DNAMAN 8软件Clustal W方法分析S1和ORF3基因序列,并使用MEGA 6软件邻近法构建系统发育树。结果表明,PEDV的阳性率和猪场阳性率分别为92.25%和94.03%,其中129份样品中有119份为PEDV阳性,67个猪场中有63个为PEDV阳性。根据S1基因的系统发育分析,我们的分离株全部属于G2(变异株)型,与中国分离株(HN1303、CH/ZMDZY/11和AJ1102)、韩国(AD01)和美国(MN、IA1、IA2和13-019349)毒株亲缘关系接近,但与其他中国毒株(LZC、CH/HNZZ/2011和SD-M)、韩国(SM98)及日本(83-P5和MK)毒株亲缘关系较远。此外,我们的分离株与减毒疫苗株CV777(中国使用)和DR13(韩国使用)亲缘关系较远。根据氨基酸序列分析,我们检测到一种新的PEDV变异株,即:CH/HNLY,与CV777减毒株相比,CH/HNLY毒株在S蛋白第375 aa位点处有4-aa的插入和1-aa的缺失(RSSS/T),在第430 aa位点处有1-aa(D)的缺失,这些突变均位于受体结合域上。ORF3基因分析显示PEDV分离株均为变异株,并且分离株与疫苗株在遗传上亲缘关系较远。这些研究结果表明PEDV在地理上存在遗传多样性,为进一步研究PEDV受体和新的有效疫苗的设计提供了一定基础。2.建立了一种新的双重TaqMan RT-qPCR用于鉴别检测中国PEDV经典株和变异株。结果表明两种探针对标准重组质粒不存在交叉扩增,并且通过使用其他7种非PEDV猪病病原进一步证实了其特异性。检测PEDV经典株和变异株的最低拷贝数为4.8×10~2DNA拷贝/反应。我们使用标准重组质粒评估了TaqMan RT-qPCR的可重复性,变异系数为0.19-4.93。我们收集了近5年来中国中部地区腹泻仔猪的79份临床标本。在这些临床样本中,传统RT-PCR方法检测出了51份PEDV阳性样本,而用双重TaqMan RT-qPCR检测出了63份PEDV变异株,3份变异株和经典株的共感染及1份经典株,病毒拷贝数分别为10~2-10~8,10~2-10~3和10~4拷贝/反应。因此,该双重TaqMan RT-qPCR可用于鉴别检测PEDV经典株和变异株。结果显示,PEDV变异株在中国中部的临床样本中普遍存在。此外,本研究首次检测到了PEDV经典株和变异株的共感染,可能有助于解释近年来新型重组PEDV毒株的出现。3.从2014年4月到2018年4月以来收集的美国俄亥俄地区的43份PEDV阳性临床样本,包括猪粪便、小肠组织和口腔液中,共检测到了4种类型的PEDV S1蛋白N端大片段缺失变异株。其中两种变异株和日本已报道的变异株相似,一个包含194-aa的TTR-2/JPN/2014(S蛋白23-216 aa),另一个是包含204-aa缺失的JKa-292/CS1de204(S蛋白27-230 aa)。另外在两个新出现的变异株中,其中一个缺失了201-aa(S蛋白30-230 aa),另一个缺失了202-aa(S蛋白24-225 aa)。我们发现的这4个大片段缺失的毒株均与原美国毒株呈共感染。这是美国首次报道临床出现S1 NTD-del PEDV和原美国毒株的共感染,表明PEDV在猪体内继续进化,这可能与疾病模式的改变有关。4.PEDV S蛋白的S1亚基N末端结构域(S1 NTD)中具有大片段缺失的PEDV变异株被称为S1 NTD-del PEDV。它们在实验感染的猪体内复制良好。然而在猪场,它们多与含有完整S蛋白(S-intact)的PEDV呈共感染。我们旨在通过两种重组PEDV,icPC22A及其S1 NTD-del形式icPC22A-S1Δ197,共感染无菌新生仔猪,进而表征病毒的复制和发病机制。另外,在牛粘蛋白(BM)、猪胃粘蛋白(PGM)、猪胆汁和胆汁酸条件下,对两种病毒在Vero和IPEC-DQ细胞中的感染和复制进行比较。结果表明,在与icPC22A和icPC22A-S1Δ197共感染的猪中,icPC22A的复制达到了比无icPC22A-S1Δ197存在时更高的峰值。icPC22A组与共感染组的腹泻和肠萎缩严重程度是相似的,但均显著高于icPC22A-S1Δ197组。在Vero和IPEC-DQ细胞中,一定浓度的BM、PGM、胆汁和胆汁酸显著增强了icPC22A的感染,但对icPC22A-S1Δ197没有影响或具有抑制作用。这些结果表明,在仔猪共感染期间,S-intact PEDV的复制得到了增强。胃肠道中的粘蛋白、胆汁和胆汁酸对S-intact PEDV的感染具有促进作用,但对S1 NTD-del PEDV没有影响或具有抑制作用,这一结果部分解释了两种病毒在猪体内的共感染机制。