在工业微生物发酵过程中,由于微生物代谢和机械搅拌持续产生热量致使发酵温度不断升高。然而高温会对微生物的生长和生产造成不利影响;因此需要对反应器进行冷却控温,从而造成大量能耗。提高微生物的耐热性使其能在高温下进行发酵不仅能够降低发酵成本,而且可以提高发酵速率。为此,本文将从酿酒酵母中挖掘与蛋白质质量控制(protein quality control,PQC)相关的基因与强启动子FBA1p进行设计,构建了单功能和多功能的PQC基因元器件以提高酵母的耐热性,为其发酵过程的节能降耗提供了新思路。主要研究结果如下:(1)挖掘了酿酒酵母自噬系统基因2个、26S泛素蛋白酶体系统基因12个及分子伴侣相关基因2个,构建了16个单功能PQC基因元器件,并获得相应的工程菌。通过梯度升温培养和恒定高温培养筛选出了4个能提高酿酒酵母耐热性的PQC基因元器件(FBA1p-RSP5、FBA1p-ATG8、FBA1p-UBC4和FBA1p-HSP104)。其所对应的4株工程菌(S.c-RSP5、S.c-ATG8、S.c-UBC4和S.c-HSP104)在40℃培养84h时,OD660比对照组高分别提高了32.5%、43.6%、38.0%和49.7%;生理特性研究表明,与对照组相比耐热工程菌具有更高的热激存活率、海藻糖-6-磷酸合成酶及几丁质合酶表达量。(2)对4个单功能耐热PQC基因元器件进行理性设计与组合,构建了3个多功能PQC基因元器件(FBA1p-HSP104-SLM5t-CDC60p-ATG8-MSR1t,FBA1p-HSP104-SLM5t-CDC60p-UBC4-MSR1t和SSA1p-UBC4-SLM5t-CDC60p-ATG8-MSR1t-FBA1pRSP5)。实验表明,多功能PQC基因元器件比单功能PQC基因元器件能更好提高酵母的耐热性、细胞活力与细胞壁完整性,这表明来自蛋白质质量控制系统不同机制的基因能够协同提高酵母耐热性。利用耐热工程菌进行高温乙醇发酵,结果表明,多功能耐热工程菌的生长及乙醇产量都要优于单功能耐热工程菌,其中S.c-HA、S.c-HU和S.c-RAU的OD660比原始菌(WT)分别提高17.3%、42.9%和56.9%,接近WT在常规条件下生长情况;乙醇产量比含空载体的对照菌(WT/V)提高37.0%、40.7%和37.0%,并达到了WT在常规条件下的乙醇产量,表明通过调控胞内蛋白质代谢平衡可以有效地提高酵母细胞的耐热性。