目的　　乳腺癌是严重威胁女性生命和生活质量的恶性肿瘤，化疗药物由于可以延长患者生存期及改善预后，其临床疗效受到认可，但治疗过程中出现的肿瘤耐药性或肿瘤复发限制了化疗药物的临床应用，受到广泛研究和关注。　　近年来，越来越多的研究表明肿瘤组织中肿瘤间质细胞与肿瘤细胞相互作用形成的微环境，影响肿瘤发生发展和治疗的效果。在肿瘤微环境中，含有较多的炎性细胞和基质细胞，肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophage，TAM）作为肿瘤微环境中炎性细胞的重要组成部分，可影响肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等生物学行为。TAM根据其功能的不同，分为M1型TAM和M2型TAM，其中，M1-TAM产生于肿瘤的早期，具有高抗原呈递，杀伤病原体和抗肿瘤免疫反应的作用。M2-TAM通常在肿瘤晚期产生，其抗原呈递和杀伤胞内病原体的能力下降，具有抑制免疫应答的能力，主要发挥促进肿瘤发生发展的作用。研究发现，乳腺癌临床标本中M2-TAM型巨噬细胞极化标志物CD163表达明显增加，与乳腺癌的侵袭转移及患者预后呈正相关。将M2-TAM与乳腺癌细胞共培养后可明显增加乳腺癌细胞增殖、侵袭转移能力。然而，TAM是否可影响乳腺癌细胞药物敏感性，目前尚不清楚。　　鉴于不同表型TAM在肿瘤发生发展中的功能差异，抑制M2-TAM极化，改变TAM的表型，将可能成为未来肿瘤治疗的靶点。硫化氢(H2S)作为新发现的气体信号分子，目前已发现其可通过KATP通道途径和cAMP途径在自发性高血压、慢性阻塞性肺气肿等多种疾病过程中发挥重要的病理生理效应，此外，有文献报道H2S在炎症反应发挥重要作用，其可抑制人巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)等炎性因子的分泌。因此，我们推测H2S可能影响TAM极化。　　基于上述研究报道，本研究拟开展如下研究内容:(1)通过不同刺激因子分别诱导不同表型TAM，与乳腺癌细胞共培养模拟体内微环境，检测M1、M2表型TAM对乳腺癌细胞侵袭、迁移及化疗药物敏感性的影响;(2)应用H2S处理TAM，观察H2S对TAM极化及其介导的乳腺癌细胞药物敏感性的调控作用。本研究结果为阐明肿瘤微环境影响乳腺癌药物敏感性研究提供新思路，为针对M2-TAM极化为靶点的乳腺癌诊治提供理论与实验依据。　　实验方法　　选用人白血病单核THP-1细胞，通过PMA使其诱导为Mφ巨噬细胞，然后加入LPS诱导为M1-TAM或加入IL-4诱导为M2-TAM;流式细胞仪检测TAM特异性标记物CD86+、CD163+、CD206+的比例;分别应用Real-timePCR和Westernblot方法检测TAM特异性标志物和目的蛋白的mRNA和蛋白表达水平;ELISA法检测TAM特异性分泌因子的表达水平;采用MTT、划痕实验、Transwellassay(8μm)方法分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;分别应用Transwellassay(0.4μm)以及TAM条件培养基处理乳腺癌细胞两种方法建立TAM与乳腺癌细胞共培养模型。　　实验结果　　1.TAM的诱导及鉴定:相对于诱导的Mφ和M2巨噬细胞，LPS诱导后，M1-TAM的表面标记物CD86高表达，M1-TAM标志物TNF-α、IL-1βmRNA表达升高，M1-TAM上清液中TGF-β分泌水平较低，TNF-α分泌水平增加(P＜0.05);相对于诱导的Mφ和M1巨噬细胞，IL-4诱导后，M2巨噬细胞表面标记物CD163+和CD206+高表达，M2-TAM标志物CCL22、PPAR-γmRNA高表达，M2-TAM上清液中TGF-β分泌增加，TNF-α分泌减少(P＜0.05)。结果提示THP-1细胞成功诱导为M1、M2型TAM。　　2.M2-TAM可促进乳腺癌细胞侵袭和迁移:与单独培养的MCF-7细胞比较，M2-TAM与MCF-7共培养后，可使E-cadherin表达下降，Vimentin表达升高，发生明显的EMT，同时，细胞侵袭和迁移能力也明显增加(P＜0.05);M1-TAM与MCF-7共培养后，EMT相关蛋白表达和侵袭转移作用无明显变化(P＞0.05)。　　3.M2-TAM可通过P-gp降低乳腺癌细胞阿霉素药物敏感性:与正常单独培养的MCF-7和MCF/ADR耐药细胞相比，M2-TAM条件培养基可增加MCF-7和MCF/ADR细胞阿霉素的IC50值，降低细胞对阿霉素的敏感性;同时，M2-TAM条件培养基可使MCF-7和MCF/ADR细胞耐药蛋白P-gp的mRNA和蛋白表达均明显增加(P＜0.05)，而BCRP等耐药蛋白表达无明显改变。　　4.H2S抑制M2-TAM极化:相对于M1-TAM，H2S合成酶CSE在M2-TAM细胞中低表达(P＜0.05);在M2-TAM的诱导过程中或诱导成功后加入H2S处理，M2巨噬细胞的表面标记物CD206+下降，CD86+升高;M2标志物CCL22mRNA表达下降，M1标志物TNF-αmRNA升高;M1标志物IL-1β蛋白表达升高，M2标志物PPAR-γ蛋白表达下降;M2标志物TGF-β分泌水平下降，M1标志物TNF-α分泌水平升高(P＜0.05)。　　5.H2S抑制M2-TAM介导的乳腺癌细胞药物敏感性:MCF-7和MCF/ADR细胞共培养体系中加入H2S预处理后，可使细胞对阿霉素的药物敏感性升高，IC50明显下降(P＜0.05);同时，P-gp的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。共培养体系中加入H2S合成酶抑制剂PPG后，则得到相反的结果。　　结论　　1.通过THP-1细胞诱导的M1和M2巨噬细胞具有M1、M2表型的TAMs的特性和功能，M2-TAM可诱导MCF-7乳腺癌细胞发生EMT和侵袭转移，可以作为模型细胞进行后续实验。　　2.M2-TAM可增加MCF-7和MCF-7/ADR细胞对阿霉素的耐药性，机制可能与M2-TAM促进乳腺癌细胞P-gp表达增加相关。　　3.H2S可抑制巨噬细胞向M2-TAM的极化。　　4.H2S可逆转M2-TAM介导的乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性，机制与H2S抑制M2-TAM诱导的P-gp高表达相关。