论文部分内容阅读
(第一部分)背景：血管钙化是矿物质代谢失调在心血管系统的表现。它以病变的动脉壁及瓣膜中大量钙质的沉积和骨样组织形成为标志性病理改变,动脉瓣膜是最容易受累的部位。瓣膜钙化最初被认为是一种老年退行性病变,现已证实是一个主动的炎症、增生和生物矿化的过程。新生微血管和骨样组织形成在瓣膜钙化早期的特征性表现提示了血管内皮细胞生长因子VEGF在瓣膜钙化过程中的重要作用。目的：探讨VEGF是否能够引起瓣膜内皮细胞钙化及其可能的分子机制。方法：取原代培养的人肺动脉瓣内皮细胞,VEGF作用后,以fura-2检测细胞内钙信号；荧光显微镜下观察VEGF刺激后GFP-NFAT融合蛋白的核转位；real-timePCR检测BMP-2、cbfa1、osteocalcin及osteoprotegerin等骨形成相关基因的表达；Von Kossa染色检测细胞钙化。结果：100ng/ml VEGF的刺激激发了人肺动脉瓣内皮细胞中钙振荡的产生,频率为0.3±0.03次/min,波宽80±3.5S,并引起NFAT快速的核转位。BMP-2、cbfa1、 osteocalcin及osteoprotegerin的mRNA水平在刺激后6-24小时均显著提高,并在48小时左右回落。刺激后72小时,在培养单层细胞的基质中发现钙化斑块的出现。结论：VEGF诱导瓣膜内皮细胞骨化相关基因的表达,促进内皮细胞钙化；这种作用与VEGF激发瓣膜内皮细胞钙振荡,进而引发NFAT活化及核转位有关。(第二部分)背景：Fluvastatin是一种他汀类药物,是HMG-CoA还原酶的抑制剂,可通过与HMG-CoA还原酶的活性中心结合,阻断甲羟戊酸代谢途径,起到心血管保护作用。目的：探讨fluvastatin是否能够抑制VEGF所造成的瓣膜内皮细胞钙化及其与细胞内钙信号间的关系。方法：培养的人肺动脉内皮细胞以fluvastatin预先处理24小时,再给予100ng/ml VEGF刺激,fura-2检测细胞内钙信号；表达GFP-NFAT融合蛋白的质粒转染细胞,荧光显微镜下观察VEGF刺激后GFP-NFAT的核转位；real-time PCR检测BMP-2、cbfa1、osteocalcin及osteoprotegerin等骨形成相关基因的表达；Von Kossa染色检测细胞钙化。结果：10nM fluvastatin的预处理抑制了瓣膜内皮细胞中钙振荡的产生及后继的NFAT核转位。BMP-2、cbfa1、osteocalcin及osteoprotegerin等骨形成相关基因的mRNA水平分别降低了(50.61±10.88)%,(82.23±22.11)%,(85.58±19.03)%和(85.57±8.42)%。VEGF刺激后72小时,在培养单层细胞的基质中未见钙化斑块。结论：fluvastatin有效抑制了VEGF所引起的瓣膜内皮细胞钙化,且这种作用是通过其抑制细胞内钙信号依赖的NFAT信号通路来实现。(第三部分)背景：GGPP是除胆固醇以外被statins阻断的另一类异戊二烯。研究提示statins的多种保护性药理学作用均与对GGPP的合成阻断,从而影响细胞中小G蛋白活性有关。目的：探讨fluvastatin抑制VEGF所致瓣膜内皮细胞钙化的机制方法：培养的人肺动脉内皮细胞以GGPP和fluvastatin共同预处理24小时,再给予100ng/ml VEGF刺激,fura-2检测细胞内钙信号；表达NFAT-GFP融合蛋白的质粒转染细胞,荧光显微镜下观察VEGF刺激后NFAT的核转位；real-time PCR检测BMP-2、cbfal、osteocalcin及osteoprotegerin等骨形成相关基因的表达；Von Kossa染色检测细胞钙化。结果：10nM的GGPP和fluvastatin共同预处理后,VEGF仍然可以诱导瓣膜内皮细胞中钙振荡的产生,频率为0.074±0.02次／min,波宽65.7±8.8S,以及NFAT的核转位。BMP-2、cbfal、osteocalcin及osteoprotegerin的mRNA水平较未补充GGPP前分别提高了1.88±0.16、8.44±3.56、6.59±3.7和2.34±0.16倍。VEGF刺激后72小时,在培养的单层细胞基质中发现钙化斑块的出现。结论：GGPP逆转了fluvastatin对VEGF所致血管内皮细胞钙化的抑制,说明本实验中fluvastatin对血管钙化的保护作用是通过阻断GGPP而实现。