大多数的化工产品都直接或者间接来自化石碳。随着化石碳的即将枯竭和大气中CO2含量的增加,利用生物炼制法代替石油加工来生产燃料和增值化学品已成为一种选择。然而,传统的生物发酵法所使用的原料单糖和淀粉与人类消费直接竞争,威胁粮食安全并减少生物多样性。利用微生物发酵工艺生产高价值化工产品,迫切需要寻找可持续、廉价的原料。CO2和甲酸等C1化合物被认为是缓解全球能源短缺和环境污染问题的理想原料。这些化合物在自然界中来源丰富,生产成本低廉,或作为工业副产品大量产生。C1化合物也可以从CO2和可再生能源中产生（例如,利用CO2通过电化学法合成甲酸）。目前,自然界中只有少数微生物能利用C1化合物来进行生长,但由于培养成本高、技术条件的限制,这些微生物很难满足工业化生产的要求。在大肠杆菌、酵母等工业模式微生物中对C1代谢途径进行重编程已成为解决这一问题的关键。还原性甘氨酸途径（RGP）被认为是一条最具潜力的人工固碳途径,其优势在于所涉及的酶具有耐氧性、能量效率高、独立运行且与中心代谢几乎没有重叠。目前,该途径在大肠杆菌和酵母菌中成功地运行。理论上,RGP途径可以取代糖酵解途径仅仅使用甲酸和CO2作为底物,然而RGP途径效率低,需要葡萄糖来提供部分细胞碳源和生长所需的能量。为了开发一种不需要补充葡萄糖,仅利用甲酸和CO2生长的工程菌,还需要提高该途径的同化效率。甘氨酸裂解系统（GCS）是RGP途径的核心部分。研究表明,提高甘氨酸裂解体系的催化能力对于提高RGP途径具有重要的意义。因此,深入了解GCS催化反应的机理以及探索影响GCS催化能力的重要因素为提高RGP途径的代谢通量提供了一条新的路径。本论文主要研究内容包括:1、GCS催化的甘氨酸裂解方向上的反应:成功的在体外构建GCS催化甘氨酸裂解反应,并对其动力学参数进行测定;探讨了GCS四种蛋白成分在甘氨酸裂解方向上合适的添加比例（6 P-蛋白:1 T-蛋白:2.4 L-蛋白:10 H-蛋白）;探讨了丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）对GCS反应速率的影响,在T-蛋白所催化的反应作为限速步骤时,SHMT对GCS的初始反应影响速率最大,反应速率提高了原来的40.4%;探讨Hapo对不同配比的GCS反应速率的影响,只有当P-蛋白所催化的反应作为限速步骤时,Hapo的加入会降低整个体系的反应速率。2、甲醛作为副产物存在于甘氨酸裂解反应体系中:通过高效液相色谱法证明了甲醛作为副产物存在于GCS催化的甘氨酸裂解体系中。甘氨酸裂解体系中甲醛产生的三种途径,第一种是5,10-CH2-THF分解产生;第二种是THF氧化产生;第三种是T-蛋白在缺乏的情况下,连接有氨甲基形式的H-蛋白(Hint)直接反应生成还原形式的H-蛋白(Hred),NH3和甲醛。本实验成功的在体外利用GCS催化甘氨酸裂解产生的甲醛为底物偶联另外三种酶来生产1,3-PDO。首次在体外证明了该途径的可行性。3、GCS催化的甘氨酸合成方向上的反应:体外建立甘氨酸合成反应体系,并确定了反应体系中的限速步骤（羧化反应,P-蛋白）。通过研究GCS各组分对甘氨酸合成速率的影响,发现提高GCS蛋白中H-蛋白的比例可以提高GCS对底物NH3和CO2的亲和力,从而大大提高甘氨酸合成方向上的催化活性。在甘氨酸合成体系中加入DTT,不仅可以提高GCS对甲醛的耐受性,而且能够提高甘氨酸的合成速率。4、H-蛋白作为酶催化甘氨酸裂解与合成反应:实验发现H-蛋白具有GCS酶的催化活性,能够在GCS酶所需的辅因子协助下,催化甘氨酸的裂解与合成反应。H-蛋白的独立催化活性与其表面的空腔密切相关,破坏空腔结构会使H-蛋白催化能力降低或丧失。5、RGP途径动力学模型的构建与分析:通过实验测定RGP途径酶在近生理条件下的动力学参数以及从数据库中挖掘参数信息,建立RGP途径动力学模型。该模型能够在体外模拟途径中底物、中间产物及产物浓度随时间的变化特征。通过参数扫描发现,GCS催化的甘氨酸合成反应对RGP途径通量影响较大,其中提高CO2和NH3对GCS的亲和力有利于提高整个RGP途径的通量。