第一部分隐丹参酮对淀粉样前体蛋白代谢的作用研究 β淀粉样蛋白(β—amyloid，Aβ)在细胞外沉积形成老年斑是阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)的主要神经病理学特征之一。Aβ被认为在神经变性及其相关的认知和行为异常中起着关键作用。大量的证据显示Aβ纤维发挥了多种神经毒性作用。因此，通过治疗干预Aβ生成与代谢，可减轻或抑制Aβ造成的损害。Aβ是由β淀粉样前体蛋白(β—amyloid precursor protein，APP)经过β—分泌酶(β—APP cleaving enzyme，BACE)和γ—分泌酶水解剪切形成。α—分泌酶在Aβ分子内水解APP释放分泌型APP片断(secretory amyloid precursor protein—α，sAPPα)，可阻止Aβ的产生。中医药的现代研究表明很多中药对中枢神经系统有保护作用，隐丹参酮作为中药丹参的重要成份，有广泛的药理作用，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡及抗血小板聚集等作用。能透过血脑屏障，改善有认知障碍小鼠的记忆。AD是一种常见的神经系统退行性疾病，其主要临床表现为进行性记忆减退和认知障碍，提示隐丹参酮可能对AD的防治有利。 本实验利用APP/PS1双转基因模型小鼠，观察隐丹参酮对小鼠行为学及Aβ斑块的影响。为了进一步研究隐丹参酮对AD的作用，在体外培养原代大鼠皮层神经元上，探讨隐丹参酮对APP代谢及对Aβ生成的影响，旨在为AD发病机制的探索和新药的开发提供理论依据。 目的： 1.在体用APP/PS1双转基因模型小鼠，观察隐丹参酮对小鼠行为学及Aβ斑块的影响。 2.在过表达突变型APP大鼠皮层神经元上观察隐丹参酮对APP代谢的作用，探讨其防治AD的机理。 方法： 选用APP/PS1双转基因模型小鼠，将其随机分为5组，另取同窝阴性小鼠作为正常对照组，每组动物10只，三个月龄后开始给药。(1)对照组(Control)：同窝阴性小鼠，每天灌胃给予等量的0.5％羧甲基纤维素钠；(2)模型组(Tg)：转基因小鼠，每天灌胃给予等量的0.5％羧甲基纤维素钠；(3)隐丹参酮低剂量组(CTS—L)：转基因小鼠，每天灌胃给予5 mg/kg剂量的隐丹参酮；(4)隐丹参酮中剂量组(CTS—M)：转基因小鼠，每天灌胃给予15 mg/kg的隐丹参酮；(5)隐丹参酮高剂量组(CTS—H)：转基因小鼠，每天灌胃给予45 mg/kg的隐丹参酮；(6)哈伯因组(HupA)：转基因小鼠，每天灌胃给予0.04 mg/kg的哈伯因。每周测体重，按体重调整用药剂量，给药4个月后，通过行为学实验测试小鼠学习记忆能力的变化。免疫组织化学染色法进行脑组织Aβ沉积的检测。体外培养大鼠脑皮层神经元并瞬时转染过表达突变型APP，隐丹参酮(2.5、5、10μM)处理后，应用MTT法检测隐丹参酮对细胞活力的影响；应用ELISA试剂盒分别测定细胞内外Aβ40，Aβ42水平；Western blot法检测CTFα、sAPPα、ADAM10、BACE及Akt的蛋白表达变化；荧光法测α、β、γ—分泌酶的活性；RT—PCR法检测ADAM10和BACE转录的变化。 结果： 1.Morris水迷宫实验显示，APP/PS1双转基因模型小鼠逃避潜伏期较正常组明显延长，原象限停留时间明显缩短。隐丹参酮组小鼠逃避潜伏期较模型组明显缩短，原象限停留时间明显延长。 2.免疫组化结果显示，APP/PS1双转基因模型小鼠脑组织Aβ斑块沉积较正常组明显增加，隐丹参酮可剂量依赖性的减少脑组织Aβ斑块的沉积。 3.隐丹参酮可剂量依赖性的减少细胞内外Aβ40、Aβ42的水平，并明显上调CTFα、sAPPα的蛋白表达。 4.隐丹参酮能剂量依赖性增加α-分泌酶活性，对β-分泌酶和γ-分泌酶活性没有影响；隐丹参酮能能剂量依赖性上调ADAM10蛋白表达，但对BACE的mRNA水平及蛋白表达表达均无明显影响。 5.用LY294002和PD98059分别阻断相应的PI3K信号通路及ERK通路，LY294002能够明显减弱隐丹参酮的作用，而PD98059无此作用；隐丹参酮可剂量、时间依赖性地上调磷酸化Akt蛋白的表达。 结论： 1.APP/PS1双转基因模型小鼠七个月后发展有明显学习记忆功能障碍，伴有脑组织Aβ大量沉积，隐丹参酮对AD模型小鼠学习记忆障碍具有明显改善作用，并且可剂量依赖性的显著降低脑组织Aβ斑块沉积。 2.隐丹参酮通过上调ADAM10蛋白的表达、增强α-分泌酶的活性，促进APP的非淀粉样代谢，可能是隐丹参酮防治AD作用的重要机理之一。 3.PI3K/Akt信号传导通路参与了隐丹参酮调节α-分泌酶的作用。 第二部分隐丹参酮抑制Aβ的聚集及对Aβ所致SH—SY5Y细胞损伤的保护作用 Aβ，老年斑的主要成分，在AD的发病和进程中起重要作用。体内外研究均显示由可溶性Aβ聚集形成的Aβ纤维有神经毒性。AD病人脑中的Aβ斑块主要引起氧化应激和炎症反应，并且Aβ能直接诱导神经元死亡。本实验室前期研究发现隐丹参酮对谷氨酸所致新生大鼠脑皮层神经元损伤有保护作用。此外，隐丹参酮对氨及东莨宕碱等多种因素导致的记忆损伤均有改善作用，但其参与AD发病的作用及机制仍不清楚。我们在体外观察隐丹参酮对Aβ聚集的作用；并用Aβ42诱导SH—SY5Y细胞损伤模型，研究隐丹参酮的神经保护作用并探讨其可能的作用机制。 目的： 1.体外观察隐丹参酮对Aβ聚集的作用。 2.观察隐丹参酮对Aβ诱导的SH—SY5Y细胞损伤的保护作用，并探讨其保护作用机理。 方法： Aβ42与隐丹参酮(0、1、2.5、5μM)置于37℃共同孵育72h，应用硫磺素T结合实验和电子显微镜观察Aβ42的聚集状态；培养SH—SY5Y细胞，隐丹参酮(0、1、2.5、5μM)与Aβ42共同作用于细胞24h，应用MTT和LDH检测细胞存活；用Hoechst染色及流式细胞仪技术检测细胞凋亡；通过荧光显微镜及流式细胞仪技术检测DHE氧化产物的荧光以测定O2-产生。 结果： 1.采用硫磺素T结合实验及电子显微镜评价隐丹参酮对Aβ42聚集的抑制作用，结果显示隐丹参酮有明显的抗Aβ42聚集作用。 2.Aβ42对SH—SY5Y细胞的毒性作用有明显的剂量、时间依赖关系，10μM的Aβ42与SH—SY5Y细胞共培养24 h，可造成SH—SY5Y细胞损伤模型。 3.采用MTT法、LDH法、Hoechst染色以及流式细胞检测评价隐丹参酮对Aβ42诱导的SH—SY5Y细胞凋亡的抑制作用，结果显示，10μM的Aβ42与SH—SY5Y细胞共孵育24 h可诱导SH—SY5Y细胞凋亡，隐丹参酮有明显的抗细胞凋亡作用。 4.10μM的Aβ42作用于SH—SY5Y细胞24 h后，倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测显示细胞内DHE荧光强度明显增强，隐丹参酮与10μM Aβ42共同作用于细胞呈剂量依赖性减少Aβ42引起的SH—SY5Y细胞O2-产生。 结论： 1.隐丹参酮呈剂量依赖性抑制Aβ42聚集。 2.隐丹参酮剂量依赖性抑制Aβ42诱导的SH—SY5Y细胞凋亡，隐丹参酮的细胞保护作用至少部分是通过对02-等自由基的清除作用而实现的。