背景心衰是高血压、冠脉疾病等重大疾病引发的心脏器质性病变的临床终末阶段,而重塑贯穿整个病理进程。研究参与重塑的基因及调控网络有利于心衰防治。我们前期发现Adtrp于心肌重塑进程中表达降低,分子流调也证实它与心血管疾病显著相关,这些均揭示它对心肌重塑的重要性。但目前关于Adtrp在心脏发生发展,特别是在心肌肥厚和心衰等与心肌重塑密切相关的病理进程中的作用仍不清楚。所以我们首先通过建立心肌组织特异性Adtrp过表达及敲除大鼠模型,正反对比,并从心脏整体功能和结构,病理组织学改变以及分子信号三个层次探究Adtrp参与心肌肥厚及心衰病理进程的作用及其分子机制,明确Adtrp的生物学作用,为心肌肥厚等心血管疾病的防治提供思路和依据。方法1.利用免疫荧光技术观察ADTRP在大鼠心肌细胞中的定位及表达情况。Western blot检测ADTRP于1月龄、2月龄、3月龄、5月龄、7月龄、12月龄及18月龄野生型SD大鼠心肌组织内时程表达特点,及在ADR（阿霉素,adriamycin）药物诱导的心衰小鼠模型,TAC（主动脉缩窄,transverse aortic constriction）诱导的肥厚型心肌病小鼠、大鼠模型的心肌组织中的蛋白表达水平变化。2.通过体外构建α-MHC启动子驱动的Adtrp基因过表达载体,利用显微注射技术构建心肌组织特异性Adtrp过表达大鼠模型（后面简称为OV）。PCR技术鉴定基因型。WB检测于心肌组织内ADTRP的表达效率。3.利用重组系统的原理（Cre/loxP）,将已建立的Adtrp cKC（条件性敲除,Conditional knockout）大鼠与心肌组织特异的Cre过表达（aMHC-Cre）大鼠进行两轮杂交繁育,即可获得心肌组织特异性Adtrp敲除（Adtrpflox/flox/MHC-Cre,后面简称为KO）大鼠。PCR技术鉴定基因型。WB检测于心肌组织内ADTRP的敲除效率。4.超声影像检测WT、OV及KO三组大鼠于1、2、3、5、7、12、18月龄时心脏功能及结构变化;7月龄时,大鼠安乐死后,摘取心脏,记录湿重数据,计算HW/BW（心脏重量与体重）比值。心脏固定并制备长轴石蜡切片,心肌显微水平病理组织学改变通过H&E及Masson染色观察。心脏固定制备电镜样本,心肌超微水平病理组织学改变利用透射电镜观察。5.选取2月龄时WT、OV及KO三组大鼠,皮下植入含有ISO的渗透泵,连续给药28天。期间记录死亡数据,给药终点经超声影像检测心脏功能及结构变化,随后安乐死后,检测HW/BW指数及病理组织学分析改变。6.通过免疫共沉淀及免疫印迹技术,进行ADTRP互作蛋白的筛选及验证。结果1.ADTRP在生理及病理情况下的表达特点分析1)ADTRP在心肌组织内,从出生后至5月龄间左右时表达水平较高,随着年龄的增长表达水平下调。2)在心肌细胞内,ADTRP主要定位在细胞膜上。3)ADTRP在ADR药物诱导的心衰小鼠模型和TAC诱导的肥厚型心肌病大鼠和小鼠模型心肌组织中表达显著下降。ADTRP在肥厚型心肌病临床样本的心肌组织中表达显著下降。2.心肌组织特异性Adtrp过表达大鼠及敲除大鼠模型的建立及表型分析1)建立了心肌组织特异性Adtrp过表达大鼠,筛选高表达且稳定遗传的首建鼠系用于后续分析。2)利用CRISPR/Cas9技术构建的Adtrp-cKO大鼠及αMHC-Cre大鼠,经过两轮杂交繁育获得了心肌组织特异性Adtrp敲除大鼠。3)在生理状态下,心肌组织特异性Adtrp过表达大鼠1月龄时室壁稍厚,随后心室腔逐渐扩张,室壁变薄,3月龄为转折点,至5月龄时已呈现显著性差异,室壁厚度下降,心室扩张,功能下降。心肌组织特异性Adtrp敲除大鼠室壁增厚,心室腔内径变小,此差异于7月龄时累积到最大。4)ISO药物处理后,心肌组织特异性Adtrp过表达大鼠室壁厚度显著下降,心室扩张,心功能下降,而心肌组织特异性Adtrp敲除大鼠可改善上述指标。5)ISO药物处理后,WT-ISO组大鼠心肌纤维出现粗细不均一性肥大,排序不齐,心肌线粒体发生肿胀。OV-ISO组大鼠心肌纤维出现明显断裂溶解,排列紊乱,肌节模糊不清,线粒体肿胀明显,发生嵴断裂。KO-ISO组大鼠心肌纤维出现局部出现不均一性肥大,心肌线粒体肿胀,较WT-ISO组的组织学改变有所缓解。3.ADTRP参与心肌肥厚失代偿调控的分子机制初步分析1)通过带有Flag标签的Adtrp表达质粒转染H9c2细胞,提取蛋白,进行质谱检测,分析得到ADTRP的互作蛋白有RHOQ、Caveolin-1和PRKAR2A。2)通过带有Flag标签的Caveolin-1表达质粒和Adtrp表达质粒共转染H9c2细胞,提取蛋白,进行反向验证,结果显示Caveolin-1为ADTRP的互作蛋白分子。结论1.ADTRP主要定位在心肌细胞膜上,在大鼠出生后至5月龄左右,表达水平较高,之后随着年龄的增长,表达水平下调。在心肌肥厚及心衰病理情况下,其表达显著下调。2.心肌组织特异性Adtrp过表达大鼠1月龄时室壁开始增厚,随后心室腔逐渐扩张,室壁变薄,3月龄为转折点,至5月龄时已呈现显著性差异,随后逐渐失代偿,室壁厚度下降,心室扩张,功能下降。心肌组织特异性Adtrp敲除大鼠室壁增厚,心室腔内径减小,与对照组间的差异于7月龄时累积到最大。3.心脏整体功能和结构改变,以及病理组织学显微和超微形态改变的结果皆表明,Adtrp过表达可加速,而Adtrp敲除可抑制ISO药物诱发的心肌肥厚至心衰的病理发展进程。4.通过免疫沉淀及免疫印迹技术,筛选确定Caveolin-1是ADTRP的相互作用分子,为后续的信号机制分析,提供了可能的方向和靶点线索。本研究揭示了 ADTRP在心脏发育及心肌肥厚失代偿病理进程中的作用,进一步明确了 ADTRP的生物学功能,最终为心血管疾病,特别是心肌肥厚及心衰等的防治,提供了理论依据和线索。背景剪接体在真核细胞新生RNA转录物的加工中起重要作用。目前已有多篇研究报道剪接复合体相关基因突变与多种临床疾病相关,而PRPF40B是已发现的编码剪接体化合物的基因之一。PRPF40B属于U2核糖核蛋白体依赖型剪接复合体相关基因,已有研究表明PRPF40B基因突变,与骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes,MDS）,慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia,CLL）、急性粒细胞白血病（Acutemyeloidleukemia,AML）以及多种实体肿瘤发生有关。所以,为深入研究PRPF40B的生物学作用,本实验室利用CRISPR/Cas9技术首次构建了 PRPF40B基因敲除大鼠模型,提供了体内动物模型工具。并且在初步的研究分析中发现该基因在心肌组织内高表达,推测该基因可能对心脏发育有影响,因此,我们利用该基因敲除大鼠模型,对心脏整体功能和结构,以及病理组织学变化进行系统观察,为该基因生物学功能的深入研究提供思路和线索。方法1.利用CRISPR/Cas9技术构建Prpf40b基因敲除大鼠,测序及PCR技术鉴定敲除大鼠构建成功及仔代大鼠基因型2.通过超声影像技术分析敲除大鼠心脏结构形态和功能改变。3.大鼠安乐死后,摘取心脏,记录湿重数据,计算HW/BW（心脏重量与体重）。心脏固定并制备长轴石蜡切片,心肌病理组织学改变通过H&E染色观察。结果1.Prpf40b基因敲除大鼠的建立及繁育经PCR鉴定和测序比对,确认Prpf40b基因敲除大鼠构建成功。2.Prpf40b基因敲除大鼠心脏结构及功能分析经超声影像学分析,与同窝阴性大鼠相比2月龄敲除大鼠心脏结构形态未见明显异常,而12月龄敲除大鼠收缩期及舒张期时心室腔内径及容积显著减小,同时每搏输出量显著减小。3.Prpf40b基因敲除大鼠心肌组织学观察经病理组织学分析,与同窝阴性大鼠相比12月龄敲除大鼠心肌出现排列不齐,心肌纤维粗细不均及肌浆网扩张等现象。结论Prpf40b基因缺失可诱发大鼠心脏整体结构形态改变及心肌组织学异常