论文部分内容阅读
第一部分透明质酸与其受体CD44在慢性哮喘ASMCs中的表达变化研究目的1、研究SD大鼠在慢性哮喘状态下，气道平滑肌细胞分泌的透明质酸（hyaluronicacid）的表达，以及其受体CD44基因和蛋白水平的表达。2、研究SD大鼠在慢性哮喘状态下，气道平滑肌细胞中透明质酸合成酶（HAS）和透明质酸酶（HYAL）基因水平的表达。材料与方法建立SD大鼠慢性哮喘模型，处死后培养原代气道平滑肌细胞，使用2~5代ASMCs。分组：正常对照组（C组）和慢性哮喘组（A组）。应用realtime PCR检测ASMCs中CD44,透明质酸合酶1、2、3和透明质酸酶1、2基因水平变化；Elisa方法检测ASMCs细胞培养上清液中HA的含量；Western-blot方法检测ASMCs中CD44蛋白水平的表达。实验结果1、慢性哮喘组大鼠ASMCs中CD44mRNA和蛋白水平表达较正常对照组明显升高（p＜0.05）。2、慢性哮喘组大鼠ASMCs分泌的HA较正常对照组明显升高（p＜0.001）。3、相对于正常对照组，慢性哮喘组大鼠ASMCs中透明质酸合酶1、2及透明质酸酶1、2mRNA表达均升高（p＜0.05）。结论与正常对照组相比，慢性哮喘气道平滑肌细胞分泌的HA以及细胞膜上其受体CD44表达明显增高，透明质酸合酶以及透明质酸酶mRNA水平表达明显增高。第二部分透明质酸对SD大鼠慢性哮喘模型气道平滑肌细胞增殖和凋亡的影响研究目的1、研究SD大鼠在慢性哮喘状态下，气道平滑肌细胞增殖和凋亡的表达。2、研究SD大鼠气道平滑肌细胞在低分子量透明质酸（LMH-HA）干预下，其细胞学活性的表达变化。3、研究SD大鼠在慢性哮喘状态下，气道平滑肌细胞中细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2）与磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（p-ERK1/2）蛋白表达和活化情况。4、研究SD大鼠气道平滑肌细胞在低分子量透明质酸（LMH-HA）干预下，气道平滑肌细胞中细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2）与磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（p-ERK1/2）蛋白表达和活化情况。材料与方法慢性哮喘模型制备，原代ASMCs培养与第一部分相同。实验分组：（1）正常对照组（C组）：即为正常对照组大鼠ASMCs，无任何刺激干预；（2）对照+低分子量透明质酸组（C+HA组）：正常对照组大鼠ASMCs加入1mg/L低分子量透明质酸刺激24小时；（3）对照+低分子量透明质酸+PD98059组（C+HA+PD98059组）：正常对照组大鼠ASMCs先加入10umol/L PD98059干预1小时，再给予1mg/L低分子量透明质酸刺激24小时；（4）慢性哮喘组（A组）：即为慢性哮喘组大鼠ASMCs，不加任何干预刺激；（5）慢性哮喘+低分子量透明质酸组（A+HA组）：慢性哮喘组大鼠ASMCs加入1mg/L低分子量透明质酸刺激24小时；（6）慢性哮喘+低分子量透明质酸+PD98059组（A+HA+PD98059组）：慢性哮喘组大鼠ASMCs先加入10umol/L PD98059干预1小时，再给予1mg/L低分子量透明质酸刺激24小时。应用Western-blot方法检测各组ASMCs中p-ERK1/2、ERK1/2蛋白水平的表达；流式细胞术、MTT法检测各组ASMCs增殖和凋亡改变。实验结果1、对比正常对照组，慢性哮喘组大鼠ASMCs增殖水平升高，凋亡水平降低，差异具有统计学意义（p＜0.05）。2、正常对照组和哮喘对照组大鼠ASMCs经LMW-HA干预后，细胞增殖均较对照组明显增加（p＜0.01）；并且ASMCs经PD98059阻断后加入LMW-HA干预，细胞增殖较对照组以及LMW-HA干预组降低，且差异有统计学意义（p＜0.01）。3、正常对照组和哮喘对照组大鼠ASMCs经LMW-HA干预后，细胞凋亡较对照组均减少（p＜0.05）；并且ASMCs经PD98059阻断后加入LMW-HA干预，细胞凋亡较对照组以及LMW-HA干预组增加，且差异有统计学意义（p＜0.05）。4、对照组ASMCs经LMW-HA干预后，p-ERK1/2、ERK1/2蛋白水平以及p-ERK1/2、ERK1/2活性比值较对照组升高（p＜0.05）。对照组ASMCs经PD98059阻断再加入LMW-HA干预后，p-ERK1/2、ERK1/2活性比值较对照组以及LMW-HA干预组显著降低（p＜0.05）。结论在慢性哮喘状态下，ASMCs增殖较正常对照组显著增加，同时凋亡水平明显降低；ASMCs在低分子量透明质酸（LMH-HA）干预下，增殖活性显著增高，凋亡减少，并且这一过程是通过ERK1/2信号转导通路实现。以上结果提示，在慢性哮喘状态下，气道平滑肌细胞向中细胞外基质中分泌的HA升高，而ECM中升高的HA和CD44又通过ERK1/2信号转导通路促进ASMCs的异常增殖，从而参与慢性哮喘气道重塑过程。