结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一,近来的研究发现,世界范围内结肠癌的发病率和死亡率都有所上升,严重威胁人们的健康和寿命。针对结肠癌临床治疗主要采用手术和化疗的策略,这些治疗措施也取得了明显的临床效果,但是肿瘤耐药的出现,使得结肠癌患者化疗敏感性出现了明显的降低,从而导致了患者复发率和死亡率的升高。为克服肿瘤细胞对化疗的耐受,很多研究者对其可能的机制进行了研究,发现了一些与肿瘤细胞耐受相关的基因,为克服肿瘤耐受提供了一定的方向。本次研究目的是寻找可能与结肠癌细胞耐药相关的基因,为临床上克服结肠癌细胞耐药提供一定的理论依据和方向。我们选取了常用构建结肠癌耐药细胞的HCT-8细胞,该细胞系的形态超微结构及生长特性均具有恶性上皮细胞特性,在给鼠接种后所生长出的瘤块与患者原始肿瘤组织相似。因HCT-8在体外进行培养时,加入长春新碱（Vincristine,VCR）,容易诱导细胞耐药,所以本研究采用不同浓度的VCR来诱导HCT-8细胞耐药,并对其耐药机制进行研究。VCR临床上常用的治疗结肠癌的化疗药物之一,是一种细胞周期特异性药物,与微管蛋白结合,从而抑制微管的组装和抑制有丝分裂中期的装配。长春新碱已广泛应用于临床治疗白血病、肺癌及其他恶性肿瘤。因为多种基因参与了肿瘤细胞耐药的调节,我们通过查阅耐药相关文献和结肠癌相关文献,选取了三种可能与结肠癌耐药相关的基因TGF-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、SIKE1（suppressor of IkappaB kinase-epsilon）和BRCA-1（breast cancer susceptibility gene l,乳腺癌易感基因1）,研究这三个基因是否参与了结肠癌HCT-8细胞的耐药以及耐药的机制。通过筛选,我们发现了BRCA-1与结肠癌耐药相关,并对其耐药机制进行了探讨。本课题包括以下三部分:第一部分:筛选结肠癌细胞耐药相关基因;第二部分:明确BRCA1与结肠癌细胞耐药、增殖和凋亡之间的关系;第三部分:BRCA1参与结肠癌细胞耐药机制的探讨。第一部分筛选结肠癌细胞耐药相关基因研究方法:1.体外构建结肠癌耐受长春新碱HCT-8细胞。2.MTT方法检测HCT-8（敏感细胞）和HCT-8/V（人结肠癌长春新碱耐药细胞）细胞IC₅₀。3.采用实时定量RT-PCR的方法检测HCT-8和HCT-8/V细胞中LAP,SIKE1和BRCA1 mRNA的表达情况。4.采用Western blotting方法检测HCT-8和HCT-8/V细胞中SIKE1和BRCA1蛋白的表达情况。5.采用ELISA方法检测HCT-8和HCT-8/V细胞中TGF-β1表达情况。6.利用siRNA方法抑制细胞中TGF-β1和BRCA1表达,利用MTT方法检测细胞IC₅₀的变化。结果:1.IC₅₀结果显示,HCT-8/V对长春新碱产生了明显的耐受,HCT-8/V的IC₅₀值（151.3±4.2）是HCT-8 IC₅₀值（8.2±1.3）约18倍。2.RT-PCR结果显示,与HCT-8细胞相比,HCT-8/V细胞中LAP和SIKE1mRNA表达水平并未出现明显的改变,BRCA1 mRNA表达水平明显升高（在HCT-8/V细胞中表达量为在HCT-8细胞中表达量的3.05倍）（P<0.05）。3.Western blotting结果显示,与HCT-8细胞相比,HCT-8/V细胞中SIKE1蛋白水平并未出现明显的变化,HCT-8/V细胞中BRCA1蛋白表达水平（0.83±0.010）较HCT-8细胞中（0.41±0.05）明显升高（P<0.05）。4.ELISA结果显示,与HCT-8细胞TGF-β1表达量（1607ng/ml±67.473）,HCT-8/V细胞中TGF-β1表达量（3323.615±118.991ng/ml）,HCT-8/V细胞中TGF-β1表达水平明显升高（P<0.05）。5.转染TGF-β1 siRNA并未引起HCT-8细胞IC₅₀发生明显的变化,而转染BRCA1 siRNA可以明显的降低HCT-8/V的IC₅₀水平,分别为HCT-8/V NC siRNA Treated组为1.055 ng/mL,HCT-8/V BRCA1 siRNA Treated组为0.178 ng/mL（P<0.05）。结论:BRCA1基因可能参与了结肠癌细胞HCT-8耐受长春新碱。第二部分BRCA1对结肠癌细胞耐药、增殖和凋亡的影响研究方法:1.利用免疫组织化学的方法检测了长春新碱化疗敏感和化疗不敏感患者肿瘤组织中BRCA1蛋白的表达。2.利用siRNA方法抑制HCT-8/V细胞BRCA1表达,利用MTT方法和CCK-8方法检测细胞存活率。流式细胞术检测经siRNA抑制BRCA1表达的HCT-8/V细胞凋亡率的改变,Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白的改变,Rhodamine 123检测细胞线粒体膜电位的改变。3.通过稳定筛选的转染对照组质粒和BRCA1 siRNA质粒的HCT-8/V细胞注射到BABL/c裸鼠建立小鼠移植瘤模型,Western blotting测肿瘤组织中凋亡相关蛋白的改变。结果:1.临床组织中BRCA1蛋白的表达敏感患者的阳性率为16.7%（5/30）,而不敏感患者的阳性率为36.7%（11/30）存在明显差异。2.利用siRNA方法干扰HCT-8/V细胞BRCA1表达后,MTT方法检测显示,NC siRNA组存活率为89%,BRCA1 siRNA组存活率为71%,与NC siRNA相比,转染BRCA1 siRNA质粒细胞存活率明显的下降（P<0.01）,差异具有统计学意义。CCK-8方法检测显示,NC siRNA组存活率为92%,BRCA1 siRNA存活率为53%（P<0.01）。与MTT检测结果相一致,转染BRCA1 siRNA可以明显的降低细胞的存活率,差异具有统计学意义,流式细胞术的方法检测结果显示,与NC siRNA质粒HCT-8/V细胞凋亡率（0.042±0.007）相比,转染BRCA1 siRNA质粒HCT-8/V细胞凋亡率（0.079±0.09）明显增加（P<0.05）,差异具有统计学意义。NC siRNA凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达量为（0.63±0.05）,转染BRCA1 siRNA质粒组凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达量为（0.86±0.09）,差异具有统计学意义。NC siRNA凋亡相关蛋白cleaved PARP表达量为（0.71±0.10）,转染BRCA1siRNA质粒组凋亡相关蛋白cleaved PARP表达量为（0.92±0.05）,差异具有统计学意义与NC siRNA质粒相（0.91±0.04）比较,转染BRCA1 siRNA质粒可以明显的降低线粒体膜电位（0.58±0.15）,诱导细胞发生线粒体途径的凋亡。3.抑制耐药细胞HCT-8/V中BRCA1表达可以明显的降低小鼠移植瘤模型肿瘤的生长速度,BRCA1 siRNA组小鼠肿瘤重量（0.213±0.022g）,NC siRNA组小鼠（0.522±0.043g）（P<0.05）,有显著统计学意义。小鼠移植瘤模型肿瘤组织中,与对照组Bcl-2表达水平（0.76±0.09）相比较,BRCA1 siRNA组细胞Bcl-2表达水平出现降低（0.35±0.05）,差异有统计学意义。而Bax表达水平并未出现明显的改变,对照组Bax表达水平为0.89±0.11,BRCA1 siRNA组Bax表达水平为0.91±0.09,但是两种的比率明显降低,对照组Bcl-2/Bax为2.54,BRCA1 siRNA组为1.20（P<0.05）,差异有统计学意义。结论:抑制耐药细胞HCT-8/V中BRCA1表达可抑制肿瘤生长,诱导肿瘤凋亡。体内抑制BRCA1的表达能有效抑制裸鼠移植瘤生长、促进肿瘤细胞凋亡。第三部分BRCA1参与结肠癌细胞耐药机制的探讨研究方法:1.Western blotting检测HCT-8细胞和HCT-8/V细胞中P-gp蛋白的表达,以及利用BRCA1 siRNA抑制BRCA1后P-gp蛋白的表达。2.Western blotting检测抑制BRCA1基因小鼠移植瘤模型P-gp表达水平。3流式细胞术检测Rhodamine 123荧光强度采用流式细胞仪,利用Rhodamine 123检测细胞内蓄积情况。Rhodamine 123在P-gp的功能检测中有重要的价值,可以利用细胞内Rhodamine 123的蓄积情况间接反映P-gp的功能。结果:1.HCT-8/V细胞中P-gp表达水平（0.89±0.07）较HCT-8细胞蛋白表达水平（0.35±0.04）明显的升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。HCT-8/V BRCA1siRNA组P-gp蛋白表达量为（0.41±0.05）,与HCT-8/V细胞中P-gp表达水平（0.89±0.07）相比,抑制BRCA1表达可以明显的降低P-gp蛋白的表达水平,差异具有统计学意义（P<0.01）。2.转染对照组肿瘤组织P-gp的表达水平为（1.35+0.23）,转染BRCA1质粒组肿瘤组织P-gp的表达水平（0.78+0.19）,转染BRCA1质粒可以明显降低肿瘤组织P-gp的表达水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.抑制BRCA1基因对Rhodamine 123细胞内蓄积的影响HCT-8组荧光强度为（44.12±3.25）×10⁴,HCT-8/V组荧光强度为（5.23±0.25）×10⁴,HCT-8/V NC siRNA组为（5.78±0.34）×10⁴,HCT-8/V BRCA1siRNA组为（38.68±4.75）×10⁴,结果显示HCT-8组和HCT-8/V比较,,HCT-8/V组中Rhodamine 123的强度减少,P<0.01,说明细胞耐药和细胞外排能力增加,和P-gp表达增加有关。HCT-8/V BRCA1 siRNA组和HCT-8/V NC siRNA组比较,荧光强度增加（P<0.01）,说明抑制BRCA1可以明显的增加细胞内Rhodamine 123的强度,提示P-gp功能的减弱,说明BRCA1使P-gp表达增加,排出Rhodamine 123能力增加结论:P-gp蛋白参与BRCA1介导的结肠癌细胞耐药。