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缺氧缺血性脑病(Hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)是围产期新生儿最常见的疾病,其中基底节损伤(Basal ganglia injury,BGI)是HIE的一种常见类型,也是导致儿童脑瘫的主要原因之一。
研究表明多巴胺(dopamine,DA)的过度释放在基底节对缺氧缺血易损性方面起重要作用。DA作为神经递质,其水平受多巴胺转运蛋白(dopamine transporter,DAT)调控,DAT是定位于多巴胺能神经末梢细胞膜上突触前膜的单胺类特异转运蛋白,它的功能是将突触间隙的多巴胺运回突触前膜,是控制脑内DA水平的关键因素。因此,Dar的重摄取功能活动将直接影响突触间隙单胺类递质DA浓度的增高或降低,从而引起多巴胺能系统的功能活动的改变。因此观察基底节DAT的变化对BGI有重要意义。
PET的发明及各种示踪剂的应用使活体生化功能的研究成为可能。11C-β-CFT作为一种DAT特异性结合剂,主要被纹状体摄取,是目前对DAT亲和力较高的正电子放射性示踪剂,可以反映DAT在脑内神经末稍的含量与分布,进而反应DA的含量和分布。11C-β-CFT多巴胺转运蛋白PET显像目前广泛应用于帕金森氏病,但在HIE中的应用研究还未见文献报道。
我们采用的实验模型是新生猪全脑缺血模型,即暂时性阻断双侧颈总动脉30分钟,同时机械吸入6％的氧气来制作急性BGI模型。该模型与临床HIE病变更接近,其病理过程也更接近临床HIE病理生理。
通过本研究,建立HIE动态的诊断和治疗的动物模型,从分子水平来研究和解释HIE的病理生理学过程,对临床窒息新生儿开展超急性期的分子影像学检查,建立早期HIE的诊断标准,使HIE的影像诊断水平提高到分子水平,为HIE的早期诊断、治疗提供客观依据。
材料与方法：
一、PET/CT显像剂的制备部分
1、在线自动化制备显像剂11C-β-CFT气相循环法合成11C-CH3I;0.3ml溶有1mg前体的丙酮在-20℃下吸附11C-CH3I;100℃标记反应3min;冷却至30℃,加1.5ml去离子水稀释后上C18柱;在＃5和＃6瓶中加10ml水清洗C18柱;在＃4中加1ml乙醇将11C-CFT淋洗下来;收集瓶中加10ml生理盐水稀释。
2、PET/CT脑显像正常新生猪PET/CT脑显像:扫描程序采用脑3D采集模式,PET图像层厚3.25mm。新生猪在戊巴比妥钠(50mg/kg,腹腔内)麻醉下颈静脉注射11C-β-CFT(1.5-2mCi/只)后动态扫描。对横断面图像进行感兴趣区(ROI)分析,绘制基底节区动态曲线。志愿者PET/CT脑显像:注射5分钟后开始采集,采集总时间10分钟,注射剂量5.6mci。
二、新生猪缺氧缺血脑损伤模型的PET/CT显像部分
1、新生猪缺氧缺血脑损伤模型的制备选用生后3-5天的健康新生猪25头,动物分成对照组5头和模型组20头。模型制备:用动脉夹阻断双侧颈总动脉,同时机械通入6％氧气30分钟。缺氧缺血后处理:终止缺氧缺血,吸入40％氧气,同时恢复双侧颈动脉血供,缝合切口。待恢复自主呼吸后停呼吸机。
2、PET/CT扫描扫描程序采用脑3D采集模式,PET图像层厚3.25mm。在缺氧缺血后0～6h、20～24h、44～48h、68～72h等时间点,新生猪颈静脉注射11C-β-CFT后立即进行动态扫描。采集结束后经计算机自动处理,重建脑断层图像,于注射后30分钟选取清晰图像进行分析。在同一层面纹状体及枕叶设定相同形状面积的区域作为感兴趣区(ROI),自动计算ROI放射计数。每个时间点至少获得2个脑组织进行病理检查。
3、组织学检查麻醉小猪后断头取脑,常规脱水、石蜡包埋、HE染色,在400倍光镜下观察大脑皮层、海马、基底核、断面的病理学改变,进行病理计分。TUNEL染色观察细胞凋亡。采用链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物酶联结法(strep tavdinperoxidase-biotin,S-P法)标记多巴胺转运蛋白(DAT)。每张切片随机取基底节区相互不重叠的5个视野,采用MICROPHOT-FXA型NIKON图像采集系统摄片,两个人进行了阳性细胞计数。
结果：
一、PET/CT显像剂的制备部分
1、11C-β-CFT的制备从CO2传到合成器上生产11C-CH3I,nor=β-CFT捕获11C-CH3I,到粗产品的转移、纯化和洗脱,11C-β-CFT的制备全自动化,从11C-CH3I到可供注射的11C-β-CFT占时3min。最终获得11C-CFT37mCi。从11C-CO2到最终产物反应时间约为1小时。放化纯＞98％,比活度＞370MBq/umol,pH值为7,衰变后溶液符合无菌和无热原要求。
2、新生猪PET/CT成像结果静脉注射后5分钟内即可见11C-β-CFT在大脑皮质、小脑及基底节区域放射性分布较高,脑白质放射性分布较低,图像清晰,左右侧放射性浓聚程度显示对称;随着时间延长,大脑皮质、小脑放射性明显减低,而基底节显示清晰;而后基底节的放射性也逐渐消退,影像逐渐模糊。30分钟后,药物在脑内分布基本稳定。
二、新生猪缺氧缺血脑损伤模型的PET/CT显像部分
1、基底节脑的病理特点基底节区HE染色正常组神经元胞浆丰富、核清晰可见、核仁清楚;模型组可见神经元嗜酸性变,和或核碎裂、核固缩,可伴有海绵状变性、层状或局灶性神经元坏死。
2、DAT的改变在正常对照组,纹状体DAT免疫反应呈若阳性。在模型组,纹状体DAT表达首先上调,然后下调。HI后,DAT阳性神经元数量开始增加,在20-24小时组和对照组比较增加有统计学意义(P＜0.05),接着开始逐渐下降。
3、PET显像结果HI后,基底节放射性摄取增加,在0-6和20-24小时组和对照组比较增加有统计学意义(P＜0.05),接着开始逐渐下降。HI后各时间点免疫组化DAT改变与PET/CT显像DAT变化呈正相关。
结论：
1、在线自动化制备11C-β-CFT效率高,速度快,放化纯高。初步显像结果表明,其可满足临床需要。
2、利用新生猪的全脑缺氧缺血模型模拟人类HI损伤是可靠的方法,可以产生旁矢状区损伤。
3、使用11C-β-CFT显像剂对多巴胺转运蛋白PET/CT。显像可以反映HI后多巴胺转运蛋白的变化,使活体内研究HIE多巴胺作用机制成为可能,并为临床诊断和治疗提供了一种有效的监测手段。