【摘 要】
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牛地方性白血病（Endemic bovine leukemia,EBL）是一种牛常见的肿瘤性疾病,病原体为牛白血病病毒（Bovine leukemia virus,BLV）,是一种逆转录病毒,属于丁型逆转录病毒属（Deltaretrovirus）。在世界范围内流行广泛,几乎遍及全世界各养牛国家,其对畜牧行业带来巨大经济损失。EBL主要导致产奶量、繁殖性能下降以及牛只死亡,目前无有效疫苗,主要控制措
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牛地方性白血病（Endemic bovine leukemia,EBL）是一种牛常见的肿瘤性疾病,病原体为牛白血病病毒（Bovine leukemia virus,BLV）,是一种逆转录病毒,属于丁型逆转录病毒属（Deltaretrovirus）。在世界范围内流行广泛,几乎遍及全世界各养牛国家,其对畜牧行业带来巨大经济损失。EBL主要导致产奶量、繁殖性能下降以及牛只死亡,目前无有效疫苗,主要控制措施是扑杀或隔离感染牛。因此,建立敏感度高、特异性强的临床诊断方法对EBL的防治尤为必要。本研究在NCBI上查找gp51和p24基因序列,将序列面向大肠杆菌源密码子优化并设计Eco RⅠ和KpnⅠ为酶切位点进行基因合成。构建重组p ET-30a-gp51、p ET-30a-p24、p GEX-6p-1-gp51和p GEX-6p-1-p24原核表达质粒,在Rosetta感受态细胞中诱导表达,蛋白大小分别为35k Da、26k Da、57k Da、48k Da。采用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱纯化表达产物,将纯化后的重组蛋白作为抗原免疫动物,制备了兔抗gp51多克隆抗体和抗p24多克隆抗体。利用p ECMV-3Flag（+）真核表达载体,构建p ECMV3Flag-gp51、p ECMV3Flag-p24真核表达质粒转染HEK293细胞,获取真核表达重组gp51和p24蛋白,鉴定多克隆抗体及自然感染BLV阳性血清对重组gp51和p24蛋白的特异性。经大肠杆菌表达获得带有GST和His标签的gp51和p24重组蛋白,通过Western-blot和ELISA筛选出最适包被抗原His-gp51和His-p24,以此为基础建立两种间接ELISA检测方法。分别用BLV-Co Co Moq PCR-2核酸检测方法、国产间接ELISA试剂盒、国产竞争ELISA试剂盒、gp51-ELISA、p24-ELISA对牛血液及对应血清进行抗体检测,国产间接、竞争ELISA试剂盒与核酸均为80.95%;gp51-ELISA与核酸检测结果为83.33%;p24-ELISA与核酸检测为85.71%;p24-ELISA、gp51-ELISA配合使用与核酸检测为90.47%。建立的ELISA检测方法与国内的商品化ELISA试剂盒在71.42%-90.48%之间,其中p24-ELISA、gp51-ELISA配合使用最高,His-gp51和His-p24重组蛋白混合包被达到92.86%,与国产间接ELISA试剂盒和竞争ELISA试剂盒分别为90.48%和80.95%。用建立的ELISA与进口ELISA试剂盒检测24份牛血清,gp51-ELISA与进口ELISA试剂盒的为83.33%;p24-ELISA与进口试剂盒的为87.50%;两种试剂盒配合使用与进口ELISA试剂盒的为83.33%。基于建立ELISA的良好应用性,对黑龙江省内各市、吉林省、辽宁省及内蒙古自治区部分地区进行了牛血清临床样本检测,血清样本来自49个牧场,共1880份,阳性样本255份,阳性牧场20个,在BLV总阳性率为13.56%（255/1880）,其中黑龙江省BLV阳性率为14.07%（233/1656）,总阳性牧场率为40.82%（20/49）。其中黑龙江阳性牧场率为38.64%（17/44）。综上所述,本研究成功表达了His-gp51、His-p24、GST-gp51以及GST-p24重组蛋白,并以重组His-gp51和His-p24蛋白为基础建立了间接ELISA检测方法、制备了兔抗BLV多克隆抗体,本实验建立的间接ELISA检测方法具有良好的特异性和灵敏度。为国内EBL的检测及BLV的血清流行病学调查增添了新的有效技术手段。
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