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目的:1.通过葡萄糖联合皮质酮干预由NE、AS、BM组成的海马区神经血管单元,建立模拟DD环境下体外海马区NVU模型,并从细胞形态、屏障功能、基础结构、分泌功能多角度建立模型评价体系。2.以模拟DD环境下海马区NVU体外模型为研究对象,给予中药复方左归降糖解郁方干预,明确其对模拟DD环境下海马区NVU体外模型的保护作用的机制,为DD的防治提供新思路。方法:1.模拟DD环境下海马区NVU模型的建立。分离并纯化的NE、AS、BM细胞建立NE+AS、AS+BM、NE+AS+BM三个正常对照组及NE+AS+G&P、AS+BM+G&P、NE+AS+BM+G&P三个模型对照组。在本课题组前期工作基础上改进其实验方法,采用葡萄糖(150mmol/L)及皮质酮(200μmol/L)干预18h,(1)细胞形态评价:倒置相差显微镜下观察各组细胞生长状态;(2)屏障功能评价:细胞电阻仪测跨内皮细胞电阻值、4 h渗漏试验;(3)基础结构评价:Western-blotting方法检测BM结构蛋白Occluding、AS缝隙连接蛋白CX43及骨架蛋白GFAP蛋白的表达;(4)分泌功能评价:ELISA法检测BM分泌蛋白LIF及AS分泌蛋白TGF-β1、GDNF、bFGF、ANG1的含量、ELISA法检测神经递质5-HT含量、流式细胞术(FCM)检测各组海马神经元的凋亡情况。2.左归降糖解郁方对模拟DD环境下海马区NVU模型的保护作用。采用方法1建立模拟DD环境下海马区NVU模型,并随机分为正常对照组、正常+空白血清组、模拟DD环境下海马区NVU模型组(模型组)、模型+(二甲双胍+氟西汀)含药血清组、模型+左归降糖解郁方含药血清组5组。除正常对照组及正常+空白血清组外其它三组造模给药18h后,(1)细胞形态评价:倒置相差显微镜下观察各组细胞生长状态;(2)屏障功能评价:细胞电阻仪测跨内皮细胞电阻值、4 h渗漏试验;(3)基础结构评价:Western-blotting方法检测BM结构蛋白Occluding、AS缝隙连接蛋白CX43及骨架蛋白GFAP蛋白的表达;(4)分泌功能评价:ELISA法检测BM分泌蛋白LIF及AS分泌蛋白TGF-β1、GDNF、bFGF、ANG1的含量、ELISA法检测神经递质5-HT含量、流式细胞术(FCM)检测各组海马神经元的凋亡情况。结果:1.与正常对照组比较,葡萄糖联合及皮质酮两细胞或三细胞模型组培养体系中NE、AS、BM细胞生长状态明显变差;跨内皮细胞电阻值显著降低,4h渗漏试验液面差显著增大(P<0.05);AS缝隙连接蛋白CX43及骨架蛋白GFAP和BM紧密连接蛋白occluding的表达明显降低(P<0.05);细胞内及细胞上清液5-HT含量明显降低(P<0.05);BM分泌蛋白LIF及AS分泌蛋白TGF-β1、GDNF、bFGF、ANG1的含量显著降低(P<0.05);海马神经元凋亡率升高(P<0.05)。2.与正常对照组及正常血清比较,模型组各项指标均出现明显异常。与模型组比较,左归降糖解郁方含药血清组生长状态明显变好;跨内皮细胞电阻值显著升高,4h渗漏试验液面差显著减小(P<0.05);AS缝隙连接蛋白CX43及骨架蛋白GFAP和BM紧密连接蛋白occluding的表达明显增加(P<0.05)。BM分泌蛋白LIF及AS分泌蛋白TGF-β1、GDNF、bFGF、ANG1的含量显著升高(P<0.05);细胞内及细胞上清液5-HT含量明显升高(P<0.05);海马神经元凋亡率降低(P<0.05)。结论:1.结合本课题组前期研究与本实验结果,选择葡萄糖(150 mmol/L)及皮质酮(200μmol/L)进行干预;结合DD临床特征及神经血管单元生理作用,采用形态学、结构、功能等多角度指标建立一套模拟DD环境下海马区NVU体外模型的评价指标。2.模拟DD环境下海马区NVU体外模型其细胞形态、屏障功能、基础结构、分泌功能的损伤,这可能是DD发生发展的病理机制。3.左归降糖解郁方可改善海马区NVU各组成细胞的生长状态,调节神经递质分泌紊乱,改善海马区NVU屏障功能,提高海马区NVU功能相关分泌蛋白LIF、TGF-β、GDNF、bFGF、ANG1表达,升高海马神经元细胞存活率,对模拟DD环境下海马区NVU体外模型有一定改善作用,值得进一步研究和开发。