研究背景原发性肝癌是我国及某些亚非地区的常见癌症,也是我国最常见的恶性肿瘤之一。目前手术切除仍被认为是首选的治疗方法,但由于80%以上的肝癌患者伴有肝硬化,使肝切除量受到一定程度的限制。而且一些肝癌生长的部位靠近第一、第二、第三肝门,给手术切除带来很大困难,因而在临床上可手术切除的病人不足总数的20%。经导管肝动脉化疗栓塞术(transcatheter hepatic arterial chemoembolization, TACE)是临床上治疗肝癌的主要方法之一。然而,在我们的临床实践中,肝癌TACE术后的远期疗效仍不理想,术后复发和转移率仍非常高,且复发和转移是导致肝癌患者死亡的主要因素。其原因现已基本查明,TACE术后因肝癌组织缺血、缺氧会导致血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达上调。而VEGF是目前已知作用最强和最专一的刺激内皮细胞增生的因子之一,它也是已知最强的血管渗透剂,比组织胺作用大5万倍。VEGF可增加微血管、特别是毛细血管后静脉和小静脉的通透性,促进血管渗漏。因此,VEGF表达程度反映肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移和血管构建水平,直接反映了肿瘤生长的速度和转移的倾向。要降低肝癌TACE术后复发和转移率,提高患者生存率,就必须阻断VEGF的信号传导路径,降低VEGF的表达水平,从而阻止肿瘤新生血管的形成。因此,临床迫切需要将TACE技术与某种靶向VEGF的抗肿瘤血管生成的基因治疗策略相结合。而RNA干扰(RNA interference, RNAi)现象的发现,为本研究提供了科学的理论依据,也是目前肿瘤治疗学领域中的研究热点。RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象是近年来RNA研究领域的一个重要的发现。RNAi是一种高度序列特异性的保守转录后基因沉默,它是由小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)诱导引起的同源性基因抑制。随着对siRNA相关研究的不断深入,越来越多的研究显示了siRNA用于基因治疗的潜在优势,科学家们开始探索其用于基因治疗的可能性。研究表明siRNA可以阻断或下调目标基因的表达,其诱导的基因沉默具有高度的特异性以及投入少、周期短、操作简单等优势,因此极有可能成为新一代的治疗性药物,具有广阔的应用前景。早期国内外学者利用RNAi技术,对卵巢癌、恶性黑色素瘤、结肠癌、胃癌等靶向性抑制VEGF的研究结果表明具有高效抑制肿瘤血管生成,但该类研究绝大多数尚局限于体外实验。自从2002年McCaffrey等首次发表了小鼠模型siRNA成功抑制目标基因的体内研究后,一些不同的研究团队也在各种动物模型中利用RNAi技术特异性地抑制了一些恶性肿瘤如肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌等肿瘤靶向基因的表达。这些体内siRNA实验的成功引起了对以发展RNA干扰为基础的治疗学上的广泛关注。2006年美国OPKO公司首次研发的靶向治疗年龄相关性黄斑变性患者的药物(商品名：Bevasiranib)问世并进入临床试验阶段,这种药物即是以VEGF基因为靶向的siRNA。RNAi技术从发现到现在很短的时间内迅速从体外细胞、动物试验发展到临床试验,充分展示了它的优越性。以siRNA为基础的RNAi技术因为其基因沉默的高度特异性、高效性和安全性,为疾病的基因治疗开辟了新的途径。RNAi技术作为肝细胞肝癌(hepatocelullar carcinoma, HCC)基因治疗策略的研究也是当前较为活跃的研究热点之一。目前,RNAi技术应用于HCC的研究有：1.针对HCC发生的免疫监视机制的研究：如人类白细胞抗原-G基因(human leucocyte antigen-G, HLA-G)在肝癌组织中异常高表达,其被认为是肝癌细胞得以逃脱宿主免疫监视的手段。研究学者构建针对HLA-G基因的shRNA真核表达质粒pGUP-GFP-Neo-HLA-G并转染于HCC Huh7细胞系后,HLA-G表达水平明显下调。与自然杀伤细胞NK-92MI细胞共同培养后,可检测到NK细胞对转染HLA-G shRNA的Huh7细胞杀伤作用明显升高。结果表明转染后Huh7细胞表达HLA-G基因下调后,NK细胞对肿瘤细胞的免疫监视功能加强,从而可降低肿瘤复发、转移的可能。2.针对HCC细胞增殖的研究：Salvi等通过RNA干扰技术沉默尿激酶性纤溶酶原激活剂(urokinase type plasminogenactivator, uPA)在HCC细胞中的表达后,能明显抑制荷瘤裸鼠体内肿瘤的生长。因此发现uPA与细胞的增殖有很重要的关系,并认为uPA有可能作为HCC治疗的分子靶点。细胞分裂周期调控磷酸酶(cell division cycle, CDC) 25B可正性调控细胞周期依赖蛋白激酶,促进细胞有丝分裂和增殖,在HCC组织中高表达。Yan等以CDC 25B-siRNA转染Hep40肝癌细胞后,CDC 25B表达抑制率达90%,使肝癌细胞阻滞于G2期,明显抑制了Hep40肝癌细胞在裸鼠中的生长。3.针对HCC侵袭和转移的研究：骨桥蛋白(osteopontin, OPN)在许多高转移的恶性肿瘤如HCC中高表达,OPN与受体结合能促进细胞增殖和迁移、浸润。Cheng等针对OPN设计shRNA并转染肝癌细胞后,OPN表达明显下调,HCC细胞生长、黏附和侵袭能力均被抑制,转染细胞在裸鼠中的成瘤性和肺转移能力均下降。Guo等筛选了肝癌转移潜能不断递增的3株肝癌细胞,用DNA芯片技术检测到这些细胞株随着转移能力的增加,蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)β表达也增加,但当用RNAi技术沉默PKCβ后,肝癌细胞株的侵袭和转移潜能明显降低,由此结果表明PKCβ在肝癌迁移过程中的作用。4.针对HCC治疗相关的研究：其一是联合放射治疗增敏的研究。DNA双链断裂修复基因(DNA damage repair protein 51, RAD51)是DNA修复系统的重要成员之一,它可通过同源重组来修复由于电离辐射等原因造成的DNA损伤,当细胞受到基因毒性药物(如丝裂霉素C)、紫外线或电离辐射的损害时,RAD51蛋白会聚集到DNA断裂处寻找同源序列来修复。RAD51基因在多种不同的肿瘤细胞(如宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌等)中过度表达,表现为细胞核局部RAD51蛋白聚集,mRNA水平升高。研究表明该基因的过度表达能增强肿瘤细胞对电离辐射以及化疗药物的耐受力。研究者将靶向RAD51基因的siRNA转染至人HCC的HepG2细胞株中发现,siRNA可抑制肿瘤细胞RAD51基因的表达,HepG2细胞对放疗的敏感性明显增强,表明靶向RAD51基因RNAi技术可作为恶性肿瘤放射增敏治疗的基因干预策略。其二是联合化疗抑制多药耐药基因的研究。同样,多药耐药基因(multi-drug resistance 1, MDR1)在多种恶性肿瘤如白血病、肺癌、胃癌、HCC等细胞中高表达。大多数的化疗药物如5-Fu、顺铂、表阿霉素等对HCC治疗不敏感,单药有效率不足20%。研究者设计靶向MDRl的siRNA转染至HCC细胞MHCC97H细胞株后,明显下调MDR1 mRNA和蛋白的表达,MTT法分析结果表明MHCC97H肝癌细胞对5-Fu、长春新碱、阿霉素的敏感性明显提高。生存素基因(survivin)也与HCC耐药有关,研究者裸鼠皮下种植耐阿霉素的SMMC7721细胞株后,通过RNAi技术向皮下成瘤的裸鼠瘤体内注射靶向survivin的siRNA后,肿瘤组织survivin表达明显下调,肿瘤对阿霉素化疗药物敏感性提高,肿瘤体积较对照组明显缩小。然而,由于siRNA分子质量较大(14000u左右),且带有大量负电荷,一般无法顺利穿越细胞膜到达细胞内,容易从肾脏排出。另外,siRNA自身的不稳定性、易被降解、半衰期短、易引起免疫反应等因素导致siRNA的生物利用度降低,影响其临床应用。由于活体肿瘤细胞的生存环境和基础条件复杂,有关RNAi技术应用于活体实验的报道多数局限于体表脏器或肿瘤局部注射,经静脉注射靶向siRNA分子治疗肿瘤的动物实验研究表明多具有药物毒性反应大、靶器官局部药物浓度低的缺点。随着研究的不断深入,研究人员发现,如何把siRNA导入试验动物或是人体内成为该技术进一步推广应用的瓶颈,也是限制RNAi得以广泛应用的主要障碍。如何提高siRNA转染效率,维持在体内的有效浓度,提高抑制效率,提高安全性成为科研工作者和临床医师迫切关注的问题。为了充分发挥RNAi的技术优势又能克服其传输上的缺点,本研究利用介入治疗技术的优势和肝癌肿瘤细胞对碘油的亲和性,通过导管超选至肿瘤供血动脉直接灌注靶向VEGF-siRNA与碘油的乳化剂,进而观察其对活体肿瘤的抑制作用。本研究将靶向VEGF siRNA的抗肿瘤血管生成的基因治疗策略与肝癌肝动脉插管化疗的TAE治疗技术相结合,通过下调肝癌患者TAE术后VEGF的表达,阻断其肿瘤血管生成的通路,达到降低肝癌复发和转移率,提高肝癌患者生存率的目的。本研究充分考虑了RNAi的特异性和高效性的基因治疗优势和经动脉插管化疗的药物传送优势,弥补两者各自的劣势,相辅相成,充分发挥两者在抗肿瘤治疗中的协同作用。本研究既建立在相关体外实验的理论基础和研究成果上,又能克服RNAi技术传输难点、靶器官局部药物浓度低、全身药物毒性反应大的缺点。国内外目前尚未见此类研究报道。研究方法1. 细胞培养：兔VX2细胞株。2. 靶向VEGF siRNA分子设计及合成：结合基因数据库和设计软件设计19nt的靶向VEGF-siRNA.3. siRNA分子转染：按Lipofectamin 2000TM试剂说明书进行转染。4. 细胞增殖活力检测：MTT法检测。5. RT-PCR半定量法检测VEGF mRNA水平：体外实验检测转染后VX2细胞VEGF mRNA表达水平。6. ELISA法检测分泌性VEGF蛋白含量：体外实验检测转染后VX2细胞分泌VEGF蛋白含量。7. 实验兔VX2肝癌模型的建立：传代VX2肿瘤细胞移植于新西兰大白兔左肝,饲养3周。8. 肝癌模型螺旋CT扫描：TACE术前1 d及术后28 d荷瘤兔行肝脏平扫及三期增强扫描,影像学方法评估肝内肿瘤生长情况。9. 实验兔分组及TACE实施：30只荷瘤兔被随机分成三组并按设计方法行TACE术。10. CT扫描检测肝脏肿瘤体积和肿瘤生长率：观察碘油沉积情况并采集影像学数据分析肝脏移植瘤的体积,并计算肿瘤的生长率。11. 病理学检查和免疫组织化学染色：常规病理学检查采用HE染色；VEGF及CD34免疫组织化学染包均采用通用型二步法；对VEGF阳性染色及MVD计数。12. 肿瘤组织RT-PCR检测及Western blotting检测：RT-PCR检测肿瘤组织VEGF mRNA的表达；Western blotting检测肿瘤组织VEGF蛋白的表达。13. 肿瘤细胞凋亡检测：采用流式细胞技术,Annexin V/PI双染法检测肿瘤细胞凋亡。14. 肝、肾毒性检测：术前1 d、术后7 d和28 d采耳缘静脉血,自动生化分析仪测量AST、ALT和血尿素氮、血肌酐水平。结果1. siRNA转染VX2细胞48h后的细胞生长活力结果显示：VEGF-sil转染和VEGF-si3转染对VX2细胞生长的抑制率显著高于scr-siRNA转染对VX2细胞生长的抑制率(P<0.01)提示靶向VEGF基因的2条siRNA分子(VEGF-sil或VEGF-si3)能够有效抑制VX2细胞生长。2. VEGF-sil转染组和VEGF-si3转染组VX2细胞的VEGF mRNA表达水平分别为(0.37±0.06)和(0.45-4-0.07),均显著低于未转染组以及scr-siRNA转染组,靶向VEGF基因的2条siRNA分子(VEGF-sil或VEGF-si3)能够特异地降低VX2细胞VEGF mRNA表达水平。3. VEGF-sil和VEGF-si3转染组对VX2细胞分泌VEGF蛋白的抑制率分别为(58.1-4-7.3)%和(51.9士7.9)%,显著高于scr-siRNA转染组对VX2细胞分泌VEGF蛋白的抑制率(3.2士0.7)%,P均<0.01。靶向VEGF基因的2条siRNA分子(VEGF-si1或VEGF-si3)能够特异地下调VX2细胞分泌VEGF蛋白。4. 肝癌模型兔肿瘤经TACE治疗后,CT显示肿瘤周边富血管区域碘油存积,肿瘤中央坏死明显。5. 术后28d高剂量组、低剂量组的肿瘤生长率分别为36.09±15.73%、79.67-4-19.63%,均小于对照组(155.18±19.42%)(P<0.05)。6. 术后28 d高剂量组、低剂量组肿瘤MVD(21.4士10.6与34.1士12.0)均小于对照组(57.9-4-16.1),VEGF表达的阳性细胞计数分别为102.15±18.33、67.40-±12.32和36.25±10.88。差别均有统计学意义(P<0.05)。7. 术后高剂量组和低剂量组肿瘤组织VEGFmRNA和VEGF蛋白的相对表达量较对照组都有明显降低,且其抑制效率随药物浓度的增加而增强。8. 术后高剂量组和低剂量组肿瘤组织细胞发生凋亡率明显高于对照组,表明VEGF-siRNA能通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤生长。9. 经TACE技术传送VEGF-siRNA不仅对肝肾无明显毒性反应,而且能抑制肿瘤弓I起的肝损害作用。结论1. 设计并筛选出最佳靶向VEGF基因的siRNA分子能在体外特异地抑制兔鳞状上皮细胞癌细胞系VX2细胞的VEGF基因转录、VEGF蛋白分泌以及VX2细胞增殖。2. 在体实验靶向VEGF-siRNA能特异性地抑制兔VX2肝肿瘤的血管生成,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤的生长。3. 经肝动脉插管灌注VEGF-siRNA碘油乳化剂能有效地传送siRNA进入体内发挥作用,为RNAi技术在肝癌治疗的传送途径开拓新思路。