AI-2的体外合成及其对植物乳杆菌细菌素合成的影响

来源 :东北农业大学 | 被引量 : 8次 | 上传用户:chrisfei
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植物乳杆菌KLDS1.0391是一株分离自内蒙古传统发酵乳制品并且能产细菌素(植物乳杆菌素MG)的菌株,其所产细菌素对G+和G-菌都有较好的抑制作用。前期研究结果显示:该菌株中存在AI-2(autoinducer-2)介导的群体感应调控系统,且信号分子AI-2在该菌株与其他乳酸菌共培养时细菌素的合成中起重要调节作用,AI-2的生物合成途径已经非常明确,S-腺苷高半胱氨酸(SAH)经Pfs(S-腺苷高半胱氨酸核苷酶)和Lux S(S-核糖高半胱氨酸裂解酶)蛋白催化可生成AI-2。为研究AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的调控作用,本课题组前期已经成功构建了原核表达载体p QE-30-lux S和p QE-30-pfs,并在大肠杆菌M15中成功表达出重组蛋白质Lux S和Pfs,为AI-2的体外合成奠定了基础。本论文主要针对重组蛋白质Lux S和Pfs的诱导表达及纯化条件进行优化,并进一步优化AI-2的体外合成条件,最终体外合成具有生物活性的AI-2。在此基础上研究外源添加AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391生长、细菌素合成的影响,并采用实时荧光定量PCR技术分析细菌素结构基因pln EF的差异表达。具体实验结果如下:(1)采用单因素实验,优化重组蛋白质Lux S和Pfs诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度,确定最佳诱导表达条件为:以LB培养基为诱导培养基,诱导前菌液OD600为0.6~0.8,IPTG浓度为0.1mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为12h。(2)采用Ni-NTA Purification System对重组蛋白质Lux S和Pfs进行纯化,优化重组蛋白质Lux S和Pfs的纯化条件,确定Lux S蛋白的最佳纯化条件为:采用添加3mol/L Na Cl的PBS缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500mmol/L咪唑的Native Elution Buffer(p H 6.5)作为蛋白洗脱液对蛋白进行纯化。Pfs蛋白的最佳纯化条件为:采用PBS缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含250mmol/L咪唑的Native Elution Buffer(p H 8.0)作为蛋白洗脱液对蛋白进行纯化。(3)在优化的诱导表达及纯化条件下,诱导表达并纯化重组蛋白质Lux S和Pfs,获得的重组蛋白质Lux S和Pfs的浓度分别为5.23mg/mL和6.71mg/m L,利用获得的重组蛋白质成功合成了AI-2,表明得到的重组蛋白质具有生物活性。(4)采用单因素实验,优化AI-2体外合成的反应温度、p H、酶浓度、孵育时间,确定AI-2的最佳体外合成条件为:2mmol/L SAH,1mg/mL Lux S蛋白,0.5mg/mL Pfs蛋白,p H 7.5,37℃孵育5h。利用优化的合成条件,成功合成具有生物活性的AI-2,活性约为阳性对照的2倍,浓度约为2mmol/L。(5)在MRS培养基中添加合成的AI-2,接种植物乳杆菌KLDS1.0391后培养,发现菌体生长速率无明显变化,细菌素产量显著增加(P<0.01),且AI-2添加量不同对细菌素合成的促进作用也不同,3%(v/v)添加量的促进作用显著大于1%和5%的添加量(P<0.01)。(6)植物乳杆菌KLDS1.0391在添加3%(v/v)AI-2的MRS培养基中37℃培养15h后,采用实时荧光定量PCR分析植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素结构基因pln EF的转录水平,发现pln EF表达量上调至空白对照的2.89倍,差异极显著(P<0.01)。结论:本课题成功优化了重组蛋白质Lux S和Pfs的诱导表达和纯化条件,成功优化了AI-2的体外合成条件。在获得的最优条件下,通过诱导表达和纯化得到重组蛋白质,并利用获得的重组蛋白质体外成功合成AI-2。AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391的细菌素合成存在明显正调控作用;AI-2添加量不同,对细菌素合成量的调控效果也不同。AI-2对植物乳杆菌生长无明显影响。
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