目的:观察补肾解毒通络方(简称补肾解毒方)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠发病的影响,包括体重变化、临床神经功能评分及CNS小胶质细胞改变等的影响,探讨不同剂量中药对EAE小鼠临床表现及组织病理的不同影响,同时通过观察EAE小鼠小胶质细胞的变化,进一步探索补肾解毒方对MS可能的干预机制,进一步推广补肾通络方在临床上的应用。方法:(1)建立C57BL/6小鼠EAE模型:选用雌性C57BL/6小鼠为实验动物,联合MOG35-55、完全弗氏佐剂(CFA)作抗原刺激C57BL/6小鼠,建立C57BL/6小鼠EAE模型。免疫当天开始,详细记录C57BL/6小鼠的发病情况,包括体重、活动能力、食欲状况,并定时给予神经功能评分。(2)动物分组及给药:选取50只8~10周雌性C57BL/6小鼠,随机分为2组,空白组10只,其余全为模型组。于免疫C57BL/6小鼠当日记为第0天,非空白组40只小鼠分四点皮下注射共计0.2ml MOG35-55抗原乳剂,经过48小时后,C57BL/6小鼠再腹腔注射0.1ml(含400ng PTX)PV一次;空白组组小鼠不给予任何药物干预。经造模后的40只C57BL/6小鼠按随机数字表法随机分为四组,各10只,即中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组和EAE模型组。中药组造模第7d开始每天给予补肾解毒方药液灌胃,高剂量组每天按10ml/kg药量给予中药200ul灌胃,中剂量组每天按5ml/kg药量给予100ul灌胃,低剂量组每天按2.5ml/kg药量给予50ul灌胃。EAE模型组和空白组给予10ml/kg的生理盐水(200ul)灌胃替代,连续灌胃2周。小鼠在喂养过程中出现死亡的予以剔除,并予以同一批次小鼠替代。(3)小鼠临床体征观察:免疫当日后每天两次观察C57BL/6小鼠的发病情况,并记录小鼠的临床指征相关指标,包含有发病周期、发病的C57BL/6小鼠数量、体重及神经功能评分改变。(4)标本采集:造模21天后处死动物,取出小鼠大脑的大脑皮层-基底节区和腰髓组织(腰椎膨大部位),放置于福尔马林液中固定。用石蜡包埋、切片。(5)病理学改变:采用苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠大脑和腰髓组织病理改变。(6)免疫组化检测:采用免疫组化法分析C57BL/6 EAE小鼠CNS内小胶质细胞的变化,检测其中枢神经系统钙离子连接蛋白-1(即Iba1)阳性表达。(7)统计学处理:采用SPSS20.0进行数据分析。结果:(1)各组小鼠发病率:正常组C57BL/6小鼠无发病,中药组C57BL/6小鼠的发病率与EAE模型组不存在显著差异,无明显意义(P>0.05);(2)发病潜伏期:高剂量组小鼠较模型组C57BL/6小鼠明显延后,差异有统计学意义(P<0.05),中、低剂量组小鼠较EAE模型组无意义。(3)体重变化:正常组C57BL/6小鼠体重逐步增加,其余各组C57BL/6小鼠总体上呈先增后减的趋向。在免疫第21天,高、中剂量组小鼠后期下降程度明显小于EAE组(P<0.05),低剂量组C57BL/6小鼠体重变化与EAE组小鼠相比较,无明显改变(P>0.05)。(4)神经功能评分:免疫第0天,各组小鼠的神经功能评分无显著差异(P>0.05);免疫第7天及免疫第14天,中药组和EAE组的神经功能评分无显著差异(P>0.05);免疫第21天,高剂量组C57BL/6小鼠的神经功能评分明显下降,低于EAE组(P<0.05)。(5)组织病理学改变:空白组C57BL/6小鼠未发现炎性病灶,EAE组小鼠见脑及腰髓组织小血管管腔扩大,周围大量炎性细胞浸润,呈现“袖套”样改变。中药组可见类似EAE模型组改变,但炎性细胞浸润程度减少,高剂量组的大脑组织及腰髓组织炎性病灶较EAE组明显减少(P<0.05)。(6)小胶质细胞(MG):EAE组大脑及腰髓组织中Iba-1的表达较空白组显著增多(P<0.01);中药、高剂量组的大脑组织Iba-1的表达较EAE组明显减少(P<0.05);中药中剂量组和高剂量组小鼠腰髓组织Iba-1的表达均较EAE组少明显减少(P<0.05)。结论:(1)应用MOG35-55诱导C57BL/6小鼠建立EAE模型,发病率高。(2)补肾解毒方能够缓解C57BL/6小鼠的临床症状,可使潜伏期延长。(3)补肾解毒方对MS的干预机制可能是通过抑制小胶质细胞的活化,达到抑制CNS炎症反应的发生。(4)补肾解毒方高剂量组与中、低剂量组相比,有明显的优势。