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热处理是果树病毒脱除中应用最广泛的一种方法,国内外学者大多集中于对病毒脱除效率的研究,而对热处理过程中寄主与病毒之间互作关系的研究甚少。本实验室已采用抑制性差减杂交技术(SSH)构建了热处理诱导带毒沙梨离体植株的差减杂交文库,共筛选到149个差异表达显著的序列表达标签(Expressed sequence tags, ESTs)(王利平,2009)。本研究以热处理和常温培养沙梨(Pyrus pyrifolia)‘黄花”离体植株为试验材料,对正向文库中的热激蛋白(high molecular weight heat shock protein,HSP70)、小分子量热激蛋白(small molecular weight heat shock protein, smHSP)、光系统Ⅱ捕光色素蛋白(photosystemⅡlight-harvesting protein, LHCII)和反向文库中的几丁质酶(chitinase,EC)、金属硫蛋白(metallothionein, MT)基因进行了验证并对热处理过程中这些基因时间动态的表达变化与苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)含量变化之间的关系进行了分析,旨在明确热处理诱导沙梨“黄花”离体植株差异表达与病毒含量变化的相关性,为进一步研究梨树病毒脱除机理提供基因参考。进一步克隆了对病毒脱除相关的HSP70和EC基因并对其进行了分子生物信息学分析,推导编码的蛋白功能,旨在明确来源于沙梨寄主HSP基因和EC基因的分子序列特征,为进一步研究HSP和EC蛋白功能提供材料。取得的主要研究结果如下：1.采用Real-time RT-PCR和RT-PCR方法对HSP70、EC、LHCII、smHSP和MT基因在热处理进程中的时间表达动态进行了分析,结果表明,热处理明显诱导HSP70、smHSP和LHCⅡ的表达,其中smHSP为非组成型表达。而EC和MT基因的表达则受热处理抑制。在37℃条件下处理,HSP70、LHCII和smHSP在1d至10d,表达量呈升高趋势,处理10d表达量达到最高值,而15d至35d表达量明显下降,在35d时表达量最低。EC和MT基因表达量在热处理1d到35d表达量呈明显下降趋势,35d时达到最低值。在热处理的不同时间进程中,沙梨“黄花”植株中ASGV含量的检测结果表明,热处理1d至10d ASGV相对含量呈明显下降趋势,处理10d至35d无检测信号。对热处理不同时间进程中沙梨植株体内各基因的动态表达量和ASGV含量动态变化之间的关系分析,推测热处理诱导并激活了寄主体内与病毒抗性相关基因HSP70、LHCII和smHSP的上调表达,而这些基因的表达又能对寄主植株内病毒的复制和扩散有抑制作用。2、克隆了沙梨“黄花”植株体内HSP70和EC基因。HSP70序列全长为1950bp,编码650个氨基酸,与已报道的来自苹果寄主的(GenBank accession No.AF161180.1)氨基酸序列同源性高达98.8%；经对主要功能的保守基序分析,确认HSP70为HSC70家族成员。EC基因序列全长为1053bp,推测编码334个氨基酸,与已报道的来自沙梨“黄冠”的该基因(GenBank accession No. FJ589784.1)氨基酸序列同源性最高,达86.9%。以上研究结果为进一步研究HSP和EC蛋白的功能提供材料。