目的:　　 1、研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)诱导人Jurkat T淋巴细胞凋亡的作用及细胞凋亡过程中caspase-3,-8,-9活性变化。　　 2、研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)诱导人Jurkat T淋巴细胞凋亡过程中胞内活性氧的变化及与rVvhA诱导的细胞凋亡的关系。　　 3、研究p38-MAPK信号通路在重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)诱导人Jurkat T淋巴细胞损伤中的作用。　　 4、为进一步了解和明确创伤弧菌溶细胞素的分子致病机制研究提供科学依据。　　 方法:　　 1、rVvhA融合蛋白的表达、纯化和复性将课题组先前已构建好的含pET28a(+)-vvhA表达质粒的E.coli BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导其表达,SDS-PAGE分析表达产物。其中以包涵体形式表达的蛋白质,用洗涤液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ进行洗涤后,以Ni2+-NTA亲合层析法纯化rVvhA融合蛋白,纯化后的rVvhA包涵体经变性、复性后,复性后的rVvhA融合蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定,rVvhA活性蛋白的活性用兔红细胞溶血实验进行分析。　　 2、rVvhA活性蛋白诱导人Jurkat T淋巴细胞凋亡分子机制初步研究将rVvhA活性蛋白作用人Jurkat T淋巴细胞,利用MTT法来初步分析rVvhA活性蛋白的细胞毒性作用；采用光镜观察、Hochest33258荧光染色、Annexin V/PI双染流式细胞仪检测rVvhA活性蛋白诱导的Jurkat T淋巴细胞凋亡；采用分光光度法检测rVvhA活性蛋白作用Jurkat T淋巴细胞后,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的变化；Westem blot免疫印迹实验检测rVvhA活性蛋白作用上述细胞后,Caspase-3的表达和活化情况。初步掌握和了解,rVvhA活性蛋白对Jurkat T淋巴细胞的细胞毒作用。　　 3、rVvhA活性蛋白诱导人Jurkat T淋巴细胞胞内活性氧(ROS)生成的初步分析将复性纯化的rVvhA活性蛋白作用于人Jurkat T淋巴细胞,观察细胞的损伤情况,利用DCHF.DA荧光探针,检测其胞内ROS产生的动态变化,并利用ROS清除剂(N-acetyl-L-cysteine,NAC)进一步观察抑制rVvhA诱导的Jurkat T细胞胞内ROS生成后,细胞的损伤情况。从而初步评价rVvhA损伤Jurkat T淋巴细胞并诱导胞内活性氧升高的生物学活性。　　 4、rVvhA活性蛋白引起人Jurkat T淋巴细胞损伤后p38-MAPK信号转导通路的研究rVvhA活性蛋白作用人Jurkat T淋巴细胞,引起细胞损伤后,利用Westernblot免疫印迹技术检测该通路信号分子p38MAPKs的表达和磷酸化情况,并利用ROS清除剂NAC、p38-MAPK信号转导通路特异性抑制剂SB203580作用细胞后,检测信号分子p38MAPKs的表达和磷酸化水平的改变。　　 结果：　　 1、创伤弧菌溶细胞素融合蛋白的表达、纯化与测活大肠杆菌 BL21DE3pET28(a+)-vhA诱导表达后可在54kDa处产生特异性表达条带,能被抗His6单克隆抗体特异性识别。表达蛋白质经三步洗涤后,再经Ni2+-NTA柱纯化,其纯度达95％以上。纯化后样品经复性后冷冻干燥,溶血活性检测为0.2μg/HU。　　 2、rVvhA活性蛋白对人Jurkat T淋巴细胞的细胞毒作用 rVvhA活性蛋白对人Jurkat T淋巴细胞具有致凋亡和诱导胞内活性氧升高的细胞毒活性。MTT实验结果表明,rVvhA活性蛋白能显著降低人Jurkat T淋巴细胞的存活率,呈剂量依赖性。rVvhA所诱导的人Jurkat T淋巴细胞的凋亡主要由胞内活性氧升高介导,并能引起Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9活性的升高。10mM NAC能显著降低由rVvhA所诱导的人Jurkat T淋巴细胞的凋亡。　　 3、rVvhA活性蛋白对人Jurkat T淋巴细胞p38-MAPK信号通路的影响 Western blot免疫印迹结果显示,1.5HU/ml rVvhA活性蛋白作用Jurkat T淋巴细胞后,p38MAPKs表达量无明显差异,但能增加上述信号分子的磷酸化程度,磷酸化程度随作用时间变化而变化。本实验中,在作用4h时,p38MAPKs的磷酸化程度最高,p38信号转导通路特异性抑制剂SB203580和ROS清除剂10mM NAC均能下调p38MAPKs的磷酸化程度和降低Jurkat T淋巴细胞的凋亡率。　　 结论:　　 本实验发现和证实rVvhA活性蛋白能诱导人Jurkat T淋巴细胞凋亡和促使其胞内活性氧升高,Caspase全酶抑制剂能一定程度降低其凋亡程度,ROS清除剂NAC亦能一定程度降低rVvhA引起的Jurkat T细胞凋亡。其凋亡可能与Caspase3、8、9有关,并主要由胞内活性氧升高所介导,其凋亡途径可能同时涉及多个凋亡信号通路。本实验发现和证实,重组创伤弧菌溶细胞素rVvhA可能通过激活ROS依赖的p38-MAPK通路损伤Jurkat T淋巴细胞,引起其凋亡或坏死。本研究结果首次发现和证实创伤弧菌溶细胞素可能是创伤弧菌杀伤人免疫细胞的重要致病因子,对进一步研究创伤弧菌的诊疗具有积极意义,为创伤弧菌溶细胞素的分子致病机制研究奠定基础。