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[研究背景及目的]结直肠癌(Colorectal cancer)是临床上最常见的恶性肿瘤之一,据统计90%的肿瘤患者死于肿瘤的转移,常规的手术治疗、化疗、放疗难以对其进行有效逆转,如何有效地早期检测和靶点治疗肿瘤的侵袭转移,寻找新的肿瘤标志物以便及早诊断和进行个体化治疗,是降低癌症恶性行为的关键,对结直肠癌防治有重大意义。上皮-间质转化(EMT)是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞发生转化的现象。研究发现,EMT现象与肿瘤的侵袭转移密切相关,在多种癌症的原位浸润和远处转移中发挥重要作用。microRNA(miRNA)是一系列内源性非编码小RNA(通常长度在18-25nt)的总称。miRNA在基因转录后起翻译抑制作用,主要是通过与靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’untranslational region,3’UTR)结合达到抑制蛋白翻译的生物学作用。最近发现miRNA在EMT过程中有重要的表达调控作用。随着研究的深入,有关miRNA与肿瘤EMT之间关系研究逐渐增多,但目前国内外探讨EMT相关miRNA在结直肠癌中的研究尚属起步阶段。[研究方法和内容]本研究小组的前期研究,采用EGF和TGF-p诱导人结肠癌细胞SW480发生EMT并采用miRNA芯片筛选出诱导过程中不同时间点的差异miRNA分子,通过初步Real-time PCR验证,从中筛选出了3个差异miRNA分子：Hsa-miR-138、Hsa-miR-139-5p Hsa-miR-1180,本课题拟从细胞和分子水平证实相关分子在结直肠癌细胞EMT过程中的细胞生物学和分子生物学特征,从临床组织标本水平验证相关差异miRNA分子的表达,并进一步结合生物信息学预测与靶基因验证的方法初步阐明相关miRNA在结直肠癌细胞EMT过程中的分子调控机制。[实验结果]1.EMT相关miRNA在结直肠癌细胞及临床组织标本中的表达：(1) Real-time PCR连续多时间点验证miR-138、miR-139-5p、miR-1180的在结肠癌细胞EMT过程中的表达。验证结果与芯片相符。(2)Real-time PCR检测24对癌组织及其配对正常粘膜组织中miR-138的表达。结果显示在22对样本中,miR-138在癌组织中的表达相较其配对正常粘膜明显下调,仅2例癌组织中miR-138表达升高,具有显著性差异,配对正常粘膜组/肿瘤组比值=2.66；miR-139-5p在18例配对标本中检测,结果显示两组间表达无显著性差异。(3)miR-138在结直肠癌、癌远端正常粘膜和淋巴结中的原位杂交结果显示：miR-138在结直肠癌组织中表达明显低于配对癌旁组织与癌远端正常粘膜,有显著性差异；癌远端正常粘膜与癌远端正常粘膜相比无统计学差异；结直肠癌原发灶表达阳性率明显低于淋巴结转移癌,两者相比有统计学差异。(4)CRC临床病理特征的相关性分析：组织芯片原位杂交结果表明,miR-138阳性表达与性别、分化程度以及有无淋巴结转移相关,与年龄、Dukes分期、远处转移无关。2. mir-138、mir-139-5p在结肠癌细胞中的生物学功能：Transwell侵袭实验表明miR-138可以减弱SW480细胞的迁移侵袭能力,miR-139-5p可以增强SW480细胞的迁移侵袭能力,流式细胞学结果表明miR-138能明显促进细胞凋亡,减慢细胞周期进程,miR-139-5p对细胞周期及凋亡影响不明显,MTT及划痕试验表明miR-138可抑制HT-29细胞的生长及增殖,并可明显抑制SW480细胞的运动迁移能力。3. miR-138、miR-139-5p调控的靶基因预测及鉴定：(1)生物信息学网站预测结果提示miR-138的靶基因参与TGF-β、Pathway in cancer等通路；miR-139-5p的靶基因参与Pathway in cancer、Colorectal cancer pathway等通路。结合预测数据进一步选择CDH1、VIM、CD44、 EZR、ZEB2、CTNNA1/2、FN1、MMP2等基因进行验证。(2) Real-timePCR检测SW480细胞转染miR-138、miR-139-5p过表达和抑制表达载体后target gene的表达以及TGF-p处NSW480细胞48h使其发生EMT,分别瞬时转染miR-138、miR-139-5p过表达载体和抑制表达载体后,Real-time PCR检测预测的target gene表达,结果初步提示miR-138target gene为EZR, miR-139-5p target gene为CDH1、ZEB2。(3)荧光素酶实验：构建了含EZRIN与miR-138结合位点及其缺失突变型的PMIR载体,含CDH1、ZEB2与miR-139-5p结合位点及其缺失突变型的PMIR载体,采用荧光素酶报告系统,结果提示：EZRIN是miR-138调控的靶基因,CDH1是miR-139-5p下游调控的靶基因。(4)Western-blot证实转染miR-138及miR-139-5p前后EZRIN、CDH1蛋白表达下调,表明：EZRIN受miR-138的转录后调控,CDH1受miR-139-5p的转录后调控。[结论]1.miR-138在结直肠癌组织和TGF-p诱导发生EMT转化的结肠癌细胞SW480中均表达下调。2.miR-138可抑制HT-29细胞的生长及增殖,抑制SW480细胞的迁移和侵袭,并可明显促进细胞凋亡,阻滞G1期细胞生长；miR-138可通过作用于靶基因EZRIN而发挥其抑制结肠癌EMT转化的功能。3. miR-139-5p在TGF-β诱导发生EMT转化的结肠癌细胞SW480中表达上调,可增强SW480细胞的迁移侵袭能力；CDH1可作为其靶基因而影响结直肠癌细胞的EMT转化。