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一.研究目的参苓白术散主治脾虚湿盛所致的腹痛、泄泻、乏力等证,对溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)、克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和腹泻型肠易激综合症(Irritable bowel syndrom,IBS)都具有一定疗效。以往研究表明此方对肠道疾病的疗效与保护肠粘膜有关。本实验通过建立UC小鼠模型,探讨其UC肠粘膜的损伤机理及参苓白术散对UC小鼠肠粘膜的修复作用及机制,为临床应用健脾方药治疗UC提供科学依据。二.研究方法60只雄性SPF级C57BL/6小鼠(体重18-22 g),按随机数字表法抽取10只作为正常对照组,剩余的50只用于造模。用于造模的小鼠饮用含3%葡聚糖硫酸钠(DSS,MW.9000-20000)的蒸馏水一周,造成结肠损伤。从造模那天开始,每天要观察小鼠的体重、毛色、精神状态、饮食饮水量、大便变化。结束造模后,赶紧恢复正常蒸馏水饮水,称重后随机将造模的50只小鼠分为5个组:模型组、柳氮磺吡啶组(SASP)、低剂量参苓白术散组、中剂量参苓白术散组和高剂量参苓白术散组。正常组和模型组小鼠按0.2 ml/10 g给予0.9%生理盐水灌胃;阳性药组灌服SASP溶液0.52 g/(kg·d);参苓白术散各组分别给予高(31.2g/kg)、中(15.6g/kg)、低(7.8g/kg)剂量的浓煎药液灌胃,每日一次,一共14天。取材及检测:于最后一次给药后,动物禁食24 h,正常提供饮水。次日,10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取材,用摘眼球法收集足够多血液,静置离心后取上清,用于检测细胞因子IL-1β。取完血后,处死动物,剪开其腹腔,截取整段结肠,测量长度后洗去肠腔内容物,然后称重。肉眼观察结肠的病变情况,在病变处(粘膜充血、红肿、溃疡)截取1 cm左右,放入含4%多聚甲醛溶液的离心管中固定,可置于室温环境中,用于后续做HE染色和AB/PAS染色。剩余结肠组织分别置于无酶冻存管中,-80℃冰箱保存,用于后续的Western blot检测各蛋白的表达以及ELISA检测结肠组织细胞因子水平。三.研究结果1.造模后小鼠的一般情况及DAI评分:造模前各组小鼠的体重基本相同,差距为1-2 g,毛色光泽,活动灵敏,大便正常,隐血试验阴性或弱阳性。造模开始后,造模组小鼠体重逐渐减轻,最后甚至低于开始适应性饲养时的平均值,与正常组相比,差异显著(P<0.01),小鼠大便逐渐由松散变成稀便,从大便隐血发展为肉眼便血,DAI评分明显升高(P<0.001)。2.给药后小鼠的一般情况、DAI评分和结肠病理改变:给药期间,正常组小鼠无异常;模型组小鼠精神逐渐好转,饮食量和体重也有所增加,肉眼便血减少;各治疗组小鼠的体重随着给药时间的延长,增长速度逐渐加快,以柳氮磺吡啶组和高剂量参苓白术散组比较突出,但各给药组与模型组小鼠在给药期间的体重增长趋势的差异并无统计学意义(P>0.05),结束给药后,各给药组小鼠的体重与模型组比较也无统计学差(P>0.05);模型组小鼠DAI评分显著高于正常组(P<0.01),各给药组小鼠的DAI评分均较模型组降低,尤其是SASP组和参苓白术散高剂量组的下降较明显,具有统计学差异(P<0.05);模型组小鼠的单位结肠长度小于正常组,差异显著(P<0.01),说明模型组小鼠的结肠长度整体上缩短;模型组小鼠的单位结肠重量较正常组增高,差异显著(P<0.01),说明模型组小鼠的结肠重量整体重于正常组。与模型组相比,各给药组小鼠的单位结肠长度有增长趋势,但无统计学意义(P>0.05),各给药组小鼠的单位结肠重量有降低趋势,但无统计学差异(P>0.05);HE染色可见,正常组小鼠的结肠壁各层均完整,粘膜微绒毛排列整齐,隐窝、腺体结构正常。模型组小鼠结肠的粘膜层出现受损脱落现象,细胞排列紊乱,部分隐窝消失,部分扩张,腺体缩短,粘膜下层稀疏,大量嗜酸性粒细胞浸润,肌层病变较少。肠粘膜炎症评分高于正常组,差异有显著性(P<0.001)。柳氮磺吡啶组小鼠结肠粘膜微绒毛和隐窝、腺管均较正常组的稍短,上皮细胞排列稍紊乱但无脱落,小部分隐窝扩张,粘膜下层炎细胞减少,肌层无病变。低剂量组的结肠病理改变与模型组相比,主要改善之处在于粘膜层完整,上皮细胞未出现脱落。中、高剂量组的结肠粘膜微绒毛和隐窝、腺管也较正常组的缩短,但粘膜层完整,小部分隐窝扩张,有中性粒细胞浸润,中剂量组粘膜下层疏松,有少量炎细胞,高剂量较之明显改善,这两者的Cooper评分均有所下降。3.结肠组织中NLRP3、NLRP6的表达、血清IL-1β和组织中IL-18的水平、结肠杯状细胞数量:模型组小鼠结肠组织的NLRP3蛋白表达比正常组升高,差异有统计学意义(P<0.01),柳氮磺吡啶组和参苓白术散高剂量组均能下调NLRP3的表达,尤其是参苓白术散高剂量组差不多下降至正常组水平,与模型组相比较,差异具有显著意义(P<0.01)。而中剂量和低剂量参苓白术散组中这两者较模型组变化不显著(P>0.05)。模型组小鼠血清中的IL-1β含量增高,比起正常组升高了约1/3,差异有统计学意义(P<0.05)。SASP和高剂量参苓白术散均能降低血清中IL-1β的浓度,相较模型组,差异有显著性(P<0.05)。而中、低剂量参苓白术散中IL-1β的浓度只比模型组稍降低,未出现统计学差异(P>0.05)。各组小鼠结肠组织IL-18水平无明显差异(P>0.05)。模型组小鼠结肠NLRP6的表达和杯状细胞数量比起正常组减少,差异显著(P<0.01)。而柳氮磺吡啶组和各剂量参苓白术散组的NLRP6表达均较模型组增加,差异有统计学意义(分别为P<0.001和P<O.O5);柳氮磺吡啶组的杯状细胞数量明显较模型组增加(P<0.001),高剂量参苓白术散的杯状细胞数量也有所增加,与模型组比较,有统计学差异(P<0.05)。参苓白术散低、中剂量组的小鼠结肠上皮杯状细胞数量与模型组相比增加不明显(P>0.05)。4.小鼠结肠组织中p-65、MLCK、p-MLC及Occludin等蛋白的表达:模型组小鼠的结肠组织出现Occludin蛋白的低表达,与正常组相比,差异具有显著性(P<0.05),而参苓白术散高剂量组Occludin蛋白的表达较模型组增加(P<0.05),其增高程度高于柳氮磺吡啶组。模型组小鼠结肠的P-65蛋白表达较正常组增加,有显著差异(P<0.01),SASP组P65蛋白表达量降低,相当于正常组水平,与模型组比,有统计学意义(P<0.01),参苓白术散高剂量组P-65蛋白表达也较模型组下调(P<0.05)。MLCK蛋白在模型组小鼠的结肠中出现高表达(P<0.01),而在四个给药组中表达量均下降,与模型组比较,差异显著(P<0.01)。各组小鼠结肠的MLC蛋白表达无明显差异(P>0.05),而P-MLC蛋白在模型组中表达增加(P<0.01),在柳氮磺吡啶组中表达下降,接近正常组水平,与模型组比较,有统计学差异(P<0.01);中、高剂量参苓白术散组MLC磷酸化也有所降低,与模型组比,有统计学差异(P<0.05)。四.研究结论1.给与参苓白术散后,小鼠的一般情况较模型组明显好转,结肠粘膜炎症减轻,说明参苓白术散能在一定程度上促进UC小鼠恢复,改善其肠道粘膜损伤。2.给与参苓白术散后,小鼠结肠NLRP3表达和血清IL-1β水平均显著下调,说明参苓白术散可能是通过下调肠道NLRP3的表达和减少活性IL-1β的水平来减轻肠道炎症反应,缓解肠粘膜损伤。3.给与参苓白术散后,小鼠结肠NLRP6的表达较模型组上调,杯状细胞数量也较之增加,说明参苓白术散修复肠粘膜的作用可能与促进杯状细胞增殖或成熟有关。4.给与参苓白术散后,小鼠结肠Occludin蛋白表达增加,MLCK的激活受到抑制,MLC的磷酸化减少,说明参苓白术散可能通过抑制MLCK/MLC通路的激活来调控肠道紧密连接蛋白,从而维持肠粘膜的正常通透性。