研究背景及目的:大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,近20年来,在我国发病率呈迅速增长的趋势,其死亡率已上升至恶性肿瘤的第三位。2型糖尿病的发病率,在世界范围内也在不断增加,预计2030年将上升至4.4%,约4.39亿人次。流行病学和临床研究均显示2型糖尿病和大肠癌之间有着共同的危险因素,且相互促进。2型糖尿病人群中,大肠癌的发病及死亡风险增加,且预后差。现有研究显示,2型糖尿病时高胰岛素、活性氧增加等与大肠癌发生发展有关,同时,2型糖尿病时去甲肾上腺素水平增高也是大肠癌发生风险增高的重要诱因。精氨酸特异性单ADP核糖基转移酶1(ART1)是一种重要的单ADP核糖基转移酶,被认为与多种细胞生物学行为有着密切的关系。课题组前期研究显示,ART1的表达变化,可以影响大肠癌细胞的增殖、侵袭转移、分化、微血管形成、自噬及凋亡,参与大肠癌的发生及发展;ART1与胰岛素信号通路肝糖原调节的负性调节子磷酸化GSK-3β蛋白表达有关,提示ART1可能在糖代谢性疾病中发挥作用。但ART1对2型糖尿病高NE状态下大肠癌生长影响及机制研究,尚未见相关报道。本课题旨在前期研究的基础上,从三方面入手,首先探讨2型糖尿病合并大肠癌患者癌组织ART1的表达变化,其次建立balb/C2型糖尿病小鼠模型,采用课题组前期制备的不同ART1表达水平的CT26细胞,建立小鼠移植瘤模型,此外,以去甲肾上腺素诱导不同ART1表达水平的CT26细胞,从在体及离体两方面,探讨ART1对2型糖尿病高NE状态大肠癌生长的影响及其可能的分子机制。为ART1作为治疗2型糖尿病合并大肠癌的候选靶点提供实验依据。方法:本研究分为三部分进行。1.2型糖尿病合并大肠癌癌组织ART1表达变化采用免疫组化方法,检测大肠癌组织ART1表达。比较大肠癌合并2型糖尿病(CRCD)组(n=37例)与大肠癌未合并糖尿病(CRCO)组(n=23例)ART1表达强度的变化,并分析ART1表达强度与糖尿病的关系。2.ART1对2型糖尿病高NE状态小鼠大肠癌生长的影响(1)离体实验选用四组CT26细胞:ART1高表达组(GFP-ART1组),空载体组(GFP-Vector组),ART1沉默组(GFP-Sh ART1组),未转染组(Un-transfection组)。1)CCK8法,评估ART1对不同NE浓度诱导CT26细胞增殖活性的影响及ART1对NE不同时间诱导CT26细胞增殖活性影响。2)流式细胞术评估ART1对NE诱导各组CT26细胞周期的影响。(2)在体实验1)2型糖尿病小鼠模型的建立采用高脂饲料喂养及腹腔注射1%链脲菌素(STZ)的方法建立2型糖尿病Balb/c小鼠模型。对照组Balb/c小鼠腹腔注射等体积生理盐水。尾静脉采血检测小鼠血糖,以确定模型的建立,同时检测去甲肾上腺素及胰岛素水平。2)不同ART1水平2型糖尿病大肠癌移植瘤体积及重量和小鼠荷瘤生存时间检测以糖尿病Balb/c小鼠为实验组,非糖尿病Balb/c小鼠为对照组,小鼠右侧腋窝皮下分别接种四组CT26细胞,即ART1高表达CT26细胞(GFP-ART1组)、ART1沉默CT26细胞(GFP-sh ART1组)、未转染CT26细胞(Un-transfection组)和空载体转染CT26细胞(GFP-Vector组),建立Balb/c小鼠大肠癌移植瘤模型。观测各组小鼠体重变化、移植瘤体积及重量;观测各组小鼠荷瘤生存时间。3)ART1高表达对2型糖尿病小鼠不同NE水平大肠癌移植瘤生长的影响采用左肾交感神经离断术,建立糖尿病血循环低NE水平Balb/c小鼠模型。尾静脉采血检测小鼠去甲肾上腺素(NE)以确定模型的建立,同时检测血糖及胰岛素水平。在小鼠右侧腋窝皮下接种ART1高表达CT26细胞。以手术组(LRD组)为实验组,未手术组(GFP-ART1组)和假手术组(LSO组)为对照组,观测各组小鼠移植瘤体积及重量。3、ART1对2型糖尿病高NE状态小鼠大肠癌生长影响的机制(1)离体实验ART1对高NE诱导的小鼠大肠癌CT26细胞p-AKT、AKT、m TOR、STAT3、Cyclin D1及c-myc蛋白表达影响选用四组CT26细胞:ART1高表达组(GFP-ART1组),空载体组(GFP-Vector组),ART1沉默组(GFP-Sh ART1组),未转染组(Un-transfection组)。以终浓度为1μmmol/l NE诱导各组CT26细胞。采用western blot检测各组细胞ART1、p-AKT、m TOR、STAT3、Cyclin D1、c-myc蛋白表达变化。(2)在体实验1)2型糖尿病高NE状态小鼠大肠癌移植瘤ART1、P-AKT、m TOR及STAT3表达变化采用Western blot方法,以非糖尿病小鼠移植瘤为对照组,检测糖尿病小鼠移植瘤组织ART1、p-AKT、AKT、m TOR、STAT3的蛋白表达变2)ART1高表达对2型糖尿病不同NE水平小鼠大肠癌移植瘤组织p-AKT、AKT、m TOR、STAT3蛋白表达影响采用western blot方法,以未手术组(GFP-ART1组)和假手术组(LSO组)为对照组,检测手术组(LRD组)移植瘤组织ART1、p-AKT、AKT、m TOR、STAT3蛋白表达变化。结果:1、2型糖尿病合并大肠癌癌组织ART1表达变化(1)免疫组化检测人大肠癌组织中ART1的表达ART1着色部位主要位于肿瘤细胞胞质及胞膜。CRCD组ART1的表达强度明显高于CRCO组,且有统计学差异(p<0.05)。即使对年龄、性别、肿瘤部位、浸润深度、等因素进行较正后,2型糖尿病仍是ART1表达强度的独立相关因素。2、ART1对2型糖尿病高NE状态小鼠大肠癌生长的影响(1)离体实验1)ART1对不同NE浓度诱导CT26细胞增殖活性影响CCK8法检测各组细胞的增殖活性。结果显示,随着NE浓度的增加,GFP-ART1、Un-transfection、GFP-Vector组细胞的增殖活性增加,但GFP-Sh ART1组细胞增殖活性无明显变化。GFP-ART1组,相较其余三组,细胞增殖活性最高,GFP-Sh ART1组相较其余三组增殖活性最低(p<0.05),Un-transfection、GFP-Vector组细胞间则无统计学差异(P>0.05)。2)ART1对NE不同时间诱导CT26细胞增殖活性影响CCK8结果显示,以终浓度为1μmmol/l NE分别诱导四组CT26细胞,在各诱导处理时间,GFP-ART1组,相较其余三组,细胞增殖活性最高,GFP-Sh ART1组相较其余三组增殖活性最低(p<0.05)。且随诱导时间的延长,GFP-ART1,Un-transfection和GFP-Vector组细胞增殖活性增加(p<0.05),但GFP-Sh ART1组细胞增殖活性似乎没有明显变化(P>0.05)。Un-transfection、GFP-Vector组细胞间则无统计学差异(P>0.05)。3)ART1对NE诱导CT26细胞周期影响NE诱导CT26细胞后,未经NE诱导的各对照组细胞:(1)ART1高表达组,未转染组及空载体组可见G1期比例明显减少,S期比例明显增加,细胞增殖指数PI明显增加(p<0.05);(2)GFP-sh ART1组,即ART1沉默组,各时期细胞分布及PI无明显改变(P>0.05)。无论各组CT26细胞有无NE诱导,GFP-ART1组,G1期比例最少,S期比例最多,PI增加(p<0.05)。Un-transfection、GFP-Vector组细胞间则无统计学差异(P>0.05)。(2)在体实验1)2型糖尿病小鼠模型的建立高脂饮食饲养及腹腔注射1%STZ后,小鼠体型肥胖,体重明显重于对照组(P<0.05);小鼠血糖、胰岛素水平明显高于对照组(P<0.01),小鼠NE也明显高于对照组(P<0.01),表明糖尿病动物模型建立成功。2)不同ART1水平2型糖尿病大肠癌移植瘤体积及重量和小鼠荷瘤生存时间变化相同ART1表达水平CT26细胞接种后,与CRCO组比较,CRCD组小鼠移植瘤体积更大,重量更重,荷瘤生存时间更短,差异均具有统计学意义(p<0.05)。CRCD组和CRCO组中,接种GFP-ART1 CT26细胞组移植瘤体积均为最大,重量最重,荷瘤生存时间最短,差异均具有统计学意义(p<0.05);接种GFP-sh ART1 CT26细胞,移植瘤体积均最小,重量最轻,荷瘤生存时间最长,差异均具有统计学意义(P<0.05);未转染组与空载组则均无明显差异(P>0.05)。3)ART1高表达对2型糖尿病小鼠不同NE水平大肠癌移植瘤生长的影响与未手术组(GFP-ART1组)和假手术组(LSO组)比较,LRD组小鼠,NE水平,胰岛素水平及血糖水平明显下降(P<0.01);移植瘤重量最轻,体积最小,差异具有统计学意义(P<0.01)。GFP-ART1组和LSO组间则无统计学意义差异(P>0.05)。3、ART1对2型糖尿病高NE状态小鼠大肠癌生长影响的机制(1)离体实验ART1对高NE诱导的小鼠大肠癌CT26细胞p-AKT、m TOR、STAT3、Cyclin D1及c-myc蛋白表达影响1)GFP-ART1组与un-transfection组相比较,ART1、p-AKT、m TOR、STAT3、Cyclin D1、c-myc蛋白表达明显增加(p<0.05)。2)GFP-sh ART1组与GFP-Vector组相比较,ART1、p-AKT、m TOR、STAT3、Cyclin D1、c-myc蛋白表达明显减少(p<0.05)。3)un-transfection组与GFP-Vector组,各蛋白表达无明显差异(P>0.05)。(2)在体实验1)2型糖尿病高NE状态小鼠移植瘤ART1、P-AKT、m TOR及STAT3表达变化Western blot显示:与CRCO组比较,CRCD移植瘤组织,ART1、m TOR、STAT3、P-AKT蛋白表达明显增加,(p<0.01),AKT的表达,两组间无明显差异(P>0.05)。2)ART1高表达对2型糖尿病不同NE水平小鼠大肠癌移植瘤组织p-AKT、AKT、m TOR、STAT3蛋白表达影响Western blot显示:未手术组(GFP-ART1组)、假手术组(LSO组)、LRD组,瘤体组织,ART1、AKT蛋白表达三组间无明显差异(P>0.05),GFP-ART1组及LSO组P-AKT,m TOR、STAT3蛋白表达明显高于LSD组及GFP-ART1组(p<0.05)。结论:1、大肠癌合并2型糖尿病时,癌组织ART1表达明显增强,且伴淋巴转移组表达强度高于未转移组。ART1表达强度与性别、分化程度及肿瘤部位无关;但对年龄、性别、肿瘤部位、侵润深度、等因素进行较正后,糖尿病仍是ART1表达强度的独立相关因素。提示ART1可能在2型糖尿病合并大肠癌时,对肿瘤发生发展发挥了一定作用。2、2型糖尿病小鼠大肠癌移植瘤生长更快,体积更大,重量更重,生存时间更短,且在ART1高表达时,上述现象更明显;沉默ART1对NE诱导的大肠癌CT26细胞增殖活性具有抑制作用,细胞主要阻滞在G1期。提示ART1对2型糖尿病小鼠大肠癌移植瘤生长具有促进作用。3、糖尿病高NE状态下,ART1可通过对AKT调节,进而影响AKT/m TOR/STAT3信号通路,干预其下游基因cyclin D1、c-myc表达,影响大肠癌细胞的增殖。ART1有望成为糖尿病伴高NE水平时合并大肠癌治疗候选靶点。