一、研究背景糖尿病是一种常见且严重的代谢性紊乱疾病,随着累及人数激增,目前已成为危害人类健康的全球性疾病。糖尿病溃疡作为糖尿病常见的并发症之一,具有创面难愈、高复发率、高截肢率及高死亡率等特点,给患者、家庭及社会带来沉重的心理压力和经济负担。目前关于糖尿病创面常规治疗包括血糖调节、创面清创、感染控制、敷料覆盖、血管再造和创面减压等,糖尿病创面整体治疗效果仍不甚理想。创面修复是一个多层面动态过程,凝血期、炎症期、增殖期、重塑期各期相互协调,精密配合,最终实现创面的快速愈合。然而,糖尿病持续高血糖环境导致创面炎症反应异常,创面肉芽组织形成、血管生成及上皮化进程受阻。由此可见,糖尿病创面是一个累及创面修复多阶段多细胞的复杂问题,继续深入研究糖尿病创面发病机制,探索新的治疗方法,从多角度调控糖尿病创面修复进程,对于糖尿病创面救治具有重大的临床意义。Netrin-1蛋白最初是作为一种神经轴突导向因子被发现,近年研究表明Netrin-1除参与神经发育及外周神经修复,在机体炎症调控、血管生成、器官纤维化、上皮细胞修复及肿瘤发生发展等病理生理过程也扮演重要作用。皮肤创面修复进程涉及早期炎症反应,中后期血管新生、胞外基质沉积、创面收缩及创面上皮化等,因此探索Netrin-1在创面修复中的作用并将其应用于糖尿病创面治疗具有很强的可行性及创新性。Netrin-1有望成为一个新的创面愈合靶标分子,为临床糖尿病创面等慢性难愈创面的治疗提供新方法。二、研究目的第一部分:探索Netrin-1蛋白分子在正常皮肤创面修复进程中的表达趋势;拮抗Netrin-1蛋白功能观察其对正常创面修复的影响。第二部分:对比Netrin-1在正常创面及糖尿病创面各修复阶段的表达差异;局部应用Netrin-1蛋白观察其对糖尿病创面修复的改善。第三部分:探索Netrin-1在持续高糖环境下对创面修复相关细胞的直接功能作用。第四部分:阐明Netrin-1促进创面修复相关细胞功能的机制并采用相关实验方法行进一步验证。三、研究方法第一部分:（1）采用C57BL/6小鼠行创面造模,不施加任何处理,按照既定时间点取材并采用蛋白免疫印迹（WB）实验研究Netrin-1在正常创面炎症期、增殖期及愈合期的时序性表达趋势;（2）采用C57BL/6小鼠行创面造模并将其随机分为两组,一组采用鼠源Netrin-1抗体静脉内注射拮抗创面修复进程中Netrin-1蛋白功能,另一组采用同型对照抗体同前操作,观察两组创面愈合轨迹并采用组织免疫荧光（F4/80+CD206+）、苏木精-伊红（HE）染色、免疫组化（CD31+）及天狼星红染色评估创面巨噬细胞表型转化、创面大体结构、血管化程度及胞外胶原沉积。第二部分:（1）临床获取健康人及糖尿病患者皮肤标本并采用WB验证Netrin-1在正常皮肤及糖尿病皮肤中的表达差异;（2）采用db/db糖尿病小鼠及同窝野生型对照小鼠（db/m）建立创面模型并按时观察取材,采用免疫组化及荧光Netrin-1标记探索Netrin-1蛋白在正常创面及糖尿病创面炎症期、增殖期及愈合期的时序性差异表达;（3）采用db/db糖尿病小鼠建立创面模型,在炎症期及增殖期行Netrin-1创面内注射外源性补充,探究Netrin-1对糖尿病创面愈合的改善并采用组织免疫荧光（F4/80+CD206+）、酶联免疫吸附试验（ELISA,炎症因子:TNF-α、IL-1β、IL-6,生长因子:TGF-β1,IGF-1,VEGF-A）、HE染色、免疫组化（Ki67+,CD31+）、天狼星红染色及WB实验（Collagen I、Collagen III、α-SMA）评估创面大体结构、炎症微环境、细胞增殖、血管化、胞外基质排布及胶原成分。第三部分:（1）建立高糖细胞培养模型并采用相关特征性细胞（巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞）功能实验验证本实验高糖细胞培养模型的可行性;（2）采用骨髓来源巨噬细胞建立高糖细胞培养模型,予以TNF-α（20 ng/m L）和IFN-γ（20 ng/m L）炎症因子联合Netrin-1同时刺激48小时,光镜下大体观察、流式细胞术、细胞免疫荧光及实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）实验验证Netrin-1对高糖炎症下巨噬细胞的M2型极化及炎症因子和生长因子表达的影响;（3）采用脐静脉血管内皮细胞建立高糖细胞培养模型,CCK8增殖实验、划痕和Transwell实验、成管实验检测Netrin-1对高糖抑制的内皮细胞的增殖、迁移及成管功能的改善;（4）采用人原代成纤维细胞建立高糖细胞培养模型,CCK8增殖实验、划痕和Transwell实验、q RT-PCR及WB实验检测Netrin-1对高糖环境下成纤维细胞增殖、运动及胶原蛋白和肌动蛋白合成的功能影响。第四部分:（1）高糖培养合并炎症因子刺激骨髓来源巨噬细胞,Netrin-1蛋白作用后收集细胞RNA并进行高通量转录组测序（RNA-seq）,筛选得到的差异基因采用GO及KEGG分析富集Netrin-1调控巨噬细胞表型转化可能的机制通路;（2）采用WB实验验证上述候选通路中的关键蛋白并采用抑制剂对核心蛋白及Netrin-1受体行特异性拮抗证实Netrin-1确实是通过该受体该通路调控巨噬细胞表型转化;（3）采用细胞免疫荧光及q RT-PCR从巨噬细胞标志物及分泌因子角度再次验证上述Netrin-1受体及通路。四、研究结果第一部分:（1）Netrin-1在小鼠正常皮肤呈现一定量表达,皮肤损伤进入炎症期、增殖期Netrin-1呈现时序性表达增高,当创面完全修复时Netrin-1表达逐渐降低;（2）采用鼠源Netrin-1抗体拮抗创面Netrin-1蛋白功能明显延缓创面愈合;巨噬细胞免疫荧光染色显示第6天创面Netrin-1拮抗组F4/80+CD206+细胞相较对照组明显减少;HE染色表明第9天对照组创面已基本完全上皮化且肉芽组织丰富,而Netrin-1拮抗组仍可见明显裸露创面且肉芽组织菲薄;CD31+免疫组化及天狼星红染色表明拮抗Netrin-1蛋白后创面血管生成减弱且胞外基质沉积不足。第二部分:（1）相较健康人皮肤,糖尿病患者皮肤Netrin-1呈现明显低表达;（2）糖尿病创面及对照正常创面Netrin-1免疫组化及荧光结果显示正常创面Nerin-1在炎症期及增殖期时序性表达升高,而同时期糖尿病创面Netrin-1表达异常,呈现明显低表达;（3）Netrin-1蛋白创面内注射明显促进糖尿病创面修复;第6天创面免疫荧光显示Netrin-1治疗组F4/80+CD206+细胞相较PBS组明显增多,ELISA结果显示Netrin-1组创面炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达减少,生长因子TGF-β1,IGF-1,VEGF-A分泌增多;组织病理学检测及WB实验揭示相较对照组,第9天创面Netrin-1组已完全实现上皮化且肉芽组织丰富,创面细胞增殖能力显著增强、新生血管明显、胶原排列紧密且Collagen I、Collagen III、α-SMA合成增多。第三部分:（1）高糖培养后巨噬细胞向M2型转化效率降低,内皮细胞及成纤维细胞增殖迁移、血管生成、基质合成能力也明显抑制,表明该高糖细胞培养模型可行;（2）光镜下大体图显示Netrin-1可诱导高糖炎症刺激后巨噬细胞形态由M1型圆形伴树突状凸起向M2型长形转变;流式细胞术及细胞免疫荧光显示Netrin-1促进高糖炎症下巨噬细胞表达M2型表面标志物CD206;q RT-PCR结果显示Netrin-1可明显抑制高糖炎症刺激下巨噬细胞M1型标志物CD86、TNF-α、IL-1β、IL-6表达,促进M2型标志物CD206、ARG-1、IL-10、VEGF表达;（3）Netrin-1明显改善高糖对血管内皮细胞增殖迁移及成管功能的抑制作用;（4）Netrin-1促进高糖环境下成纤维细胞运动及胶原蛋白和肌动蛋白合成,而对细胞增殖作用不显著。第四部分:（1）RNA-seq检测结果显示Netrin-1刺激组及对照组存在640个差异基因;进一步的GO分析富集了被明显调控的生物过程、细胞组成及分子功能,KEGG分析富集了可能作用的机制通路。结合相关背景研究,我们推测富集的PPAR信号通路可能在Netrin-1调控巨噬细胞极化中起重要作用;（2）Netrin-1促进巨噬细胞向M2型极化,其作用被PPARγ特异性抑制剂GW9662逆转;Netrin-1明显增强高糖炎症下巨噬细胞PPAR信号通路的核心蛋白p STAT3、p STAT6及PPARγ表达,采用Netrin-1 A2b受体拮抗剂MRS抑制上述效应;（3）细胞免疫荧光表明GW9662及MRS抑制Netrin-1诱导高糖炎症巨噬细胞CD206表达;q RT-PCR结果显示Netrin-1抑制高糖炎症下巨噬细胞的M1型表面标志物及炎症因子（CD86、TNF-α、IL-1β、IL-6）表达,促进M2型表面标志物及生长因子（CD206、ARG-1、IL-10、VEGF）合成;而加入GW9662或MRS逆转上述效应。五、研究结论本实验证实了Netrin-1在正常创面修复炎症期及增殖期呈现时序性增高,拮抗Netrin-1蛋白功能显著延缓正常创面修复,表明Netrin-1在正常创面修复中具有重要作用。相比正常创面,糖尿病创面在修复的各时期Netrin-1呈现异常低表达,据此我们推测糖尿病创面修复延迟的可能机制是由于Netrin-1时序性表达异常导致。进一步通过外源性Netrin-1治疗糖尿病小鼠创面及体外细胞实验,我们发现Netrin-1促进糖尿病创面修复,主要通过调控巨噬细胞表型转化、促进新生血管形成及增强成纤维细胞收缩和胶原表达实现。Netrin-1与受体A2b结合激活下游STAT/PPARγ信号通路,是Netrin-1调控巨噬细胞表型转化的关键作用通路。