当神经元受到缺血、缺氧等损伤时,兴奋性递质谷氨酸从突触前膜以及胶质细胞大量释放,使细胞外液谷氨酸浓度异常增高,作用于突触后膜上的谷氨酸受体,引起钙、钠离子内流增多而导致钙超载,从而引起神经元损伤。因此,将这些氨基酸称为兴奋性神经毒素。兴奋性氨基酸转运体(excitatory amino acid transporters, EAATs)是调控脑内细胞外液谷氨酸浓度的重要机制,其中星形胶质细胞谷氨酸转运体-1(glial glutamate transporter-1, GLT-1)在终止谷氨酸能神经传递,维持细胞外液谷氨酸浓度处于低水平方面发挥重要作用。已经证明脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning, CIP)可使大鼠海马CA1星型胶质细胞突起延长并且紧紧环绕锥体神经元,同时表达大量的GLT-1,并使其对谷氨酸的摄取增强;损伤性脑缺血可导致大鼠海马CA1区GLT-1表达下调,尤其在死亡的锥体细胞周围下调更为明显,甚至表现为大片的GLT-1表达缺失;应用GLT-1抑制剂(dihydrokainate, DHK)抑制GLT-1的功能、或应用GLT-1的反义寡核苷酸减少GLT-1的表达和功能,均可抑制CIP的脑保护作用。这些研究结果表明GLT-1参与情况下CIP所诱导的脑缺血耐受。最近有研究报道,GLT-1存在三种剪接变异体,分别为GLT-1a、GLT-1b和GLT-1c。但是,这些剪接变异体在CIP诱导的脑保护机制中是否发挥作用尚未见报道。因此,本实验观察应用GLT-1a反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, AS-ODNs)抑制大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白的表达对CIP抗脑缺血打击引起的迟发型神经元死亡作用的影响,探讨GLT-1a剪接变异体在CIP脑保护机制中的作用,为临床上脑血管疾病的防治研究提供新线索和依据。1 GLT-1a AS-ODNs抑制CIP诱导的GLT-1a蛋白表达的上调方法:正常Wistar大鼠24只,体重280-320 g,首先右侧脑室置管、建立侧脑室给药通道,恢复5天后,随机分为以下各组(n=3):1、Sham组:首先暴露双侧椎动脉,48 h后暴露双侧颈总动脉,但不阻断上述动脉内的血流。2、椎动脉凝闭组:首先凝闭双侧椎动脉、永久阻断其血流,48 h后分离暴露双侧颈总动脉,但不阻断血流。3、CIP组:首先凝闭双侧椎动脉、永久阻断其血流,48 h后分离、夹闭双侧颈总动脉、阻断血流3 min,之后恢复再灌流。4、GLT-1a AS-ODNs+CIP组:首先凝闭双侧椎动脉,10 min后侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs溶液15μl(含AS-ODNs 25 nmol),以后每间隔24 h注射一次,连续注射4次,其余同CIP组。同时,设GLT-1a Sense ODNs和GLT-1a Missense ODNs对照组,分别侧脑室注射GLT-1a的Sense ODNs和Missense ODNs溶液。以上各组中,Sham组和椎动脉凝闭组于相应处理后2 d,CIP组和GLT-1a AS-ODNs+CIP组则于CIP后2 d和5 d断头取材。低温条件下分离海马CA1区,采用Western blotting方法检测GLT-1a的蛋白表达,应用凝胶图像分析系统对Western免疫反应阳性条带进行积分光密度(integrated optical density, IOD)测定,以GLT-1a的IOD值与β-actin的IOD值的比值代表GLT-1a表达的相对水平。结果:Sham组大鼠可见海马CA1区GLT-1a蛋白的基础表达。与Sham组相比,椎动脉凝闭组GLT-1a蛋白的表达有一定程度的升高,CIP后GLT-1a蛋白的表达进一步升高,这种上调可持续到CIP后5 d。侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs,对椎动脉凝闭和CIP引起的GLT-1a蛋白的表达上调有明显的抑制作用,表现为与椎动脉凝闭组和CIP组相比,GLT-1a AS-ODNs+CIP组GLT-1a的表达明显下降(P<0.05);至CIP后5 d时,GLT-1a AS-ODNs对GLT-1a蛋白表达的抑制作用仍存在,表明GLT-1a AS-ODNs对GLT-1a蛋白表达的抑制作用可持续较长时间。此外,GLT-1a AS-ODNs对GLT-1a蛋白的基础表达也有抑制作用,表现为与Sham相比,GLT-1a AS-ODNs+CIP组GLT-1a的表达亦有所下降。侧脑室注射GLT-1a的Sense-或Missense-ODNs则对CIP引起的GLT-1a的表达无明显影响,表现为这两组GLT-1a的表达与CIP组相比无明显变化(P>0.05)。以上结果表明,侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs可以有效地抑制GLT-1a蛋白的表达。2 GLT-1a AS-ODNs抑制CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用方法:正常Wistar大鼠40只,体重280-320 g,随机分为以下8组(n=5):1、Sham组:首先暴露双侧椎动脉,48 h后暴露双侧颈总动脉,但不阻断上述动脉内的血流。2、CIP组:首先凝闭双侧椎动脉、永久阻断其血流,48 h后分离、夹闭双侧颈总动脉、阻断血流3 min,之后恢复再灌流。3、脑缺血打击组:首先凝闭双侧椎动脉,48 h后分离、夹闭双侧颈总动脉、阻断血流8 min,之后恢复再灌流。4、CIP+脑缺血打击组:首先凝闭双侧椎动脉;48 h后分离、夹闭双侧颈总动脉3 min作为CIP;再灌注2天后,再次夹闭双侧颈总动脉8 min作为脑缺血打击,之后恢复再灌注。5、人工脑脊液组:首先侧脑室置管建立侧脑室给药通道,动物恢复后5天后,给动物进行Sham手术。于分离暴露双侧颈总动脉(但不夹闭)前48 h、前24 h,后0 h、后24 h右侧脑室注射人工脑脊液,每次15μl。6、GLT-1a AS-ODNs组:右侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs,注射方法及其它步骤同人工脑脊液组。7、GLT-1a AS-ODNs+CIP组:首先给动物进行CIP。于夹闭双侧颈总动脉前48 h、前24 h,后0 h、后24 h右侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs溶液,每次15μl(25 nmol)。8、GLT-1a AS-ODNs+CIP+脑缺血打击组:在CIP+脑缺血打击组的基础上,侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs溶液,注射方法与GLT-1a AS-ODNs+CIP组相同。以上各组动物均在Sham手术、末次脑缺血或脑缺血的Sham手术后7 d断头取材,常规脑组织切片(5μm厚),硫堇染色,光学显微镜下观察海马CA1区组织学形态,确定锥体神经元迟发性死亡(delayed neuronal death, DND)情况。计数海马CA1区每1 mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目,每张切片计数3个区段,取平均数为神经元密度(Neuronal density, ND)。根据以下标准确定组织学分级(Histological grade, HG):0级,无神经元死亡;Ⅰ级,散在神经元死亡;Ⅱ级,成片神经元死亡;Ⅲ级,几乎全部的神经元死亡。结果:Sham组和CIP组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐、致密,无明显的DND,细胞形态完整,胞核饱满,核仁清晰,尼氏体丰富,HG为0～Ⅰ级,ND值分别为200.8±2.34和194.04±9.75。脑缺血打击组大鼠海马CA1区出现明显的DND,与Sham和CIP组相比,HG(Ⅱ～Ⅲ级)明显升高(P<0.01),ND值显著降低(P<0.01)。CIP+脑缺血打击组海马CA1区组织学特征与Sham组和CIP组类似,无明显DND,与脑缺血打击组相比,HG(0～Ⅰ级)明显降低(P<0.01),ND值显著升高(P<0.01),表明CIP可以诱导海马CA1区锥体神经元产生缺血性耐受,对抗缺血打击引起的DND。侧脑室注射人工脑脊液组海马CA1区组织细胞形态与Sham组基本一致,表明侧脑室置管及注射人工脑脊液不会对海马CA1区神经元产生损伤。侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs对Sham及CIP大鼠海马CA1区组织细胞形态均无明显影响,表现为GLT-1a AS-ODNs组和GLT-1a AS-ODNs+CIP组大鼠海马CA1区的组织细胞形态分别与Sham组和CIP组基本一致。但是,与CIP+脑缺血打击组相比,GLT-1a AS-ODNs+CIP+脑缺血打击组出现了明显的DND,其HG显著升高(Ⅱ～Ⅲ级)(P<0.01),ND值显著下降(P<0.01),表明GLT-1a AS-ODNs抑制了CIP所诱导的海马CA1区锥体神经元的缺血耐受,使其丧失了对抗损伤性脑缺血引起的DND的能力。以上结果表明,侧脑室注射GLT1a AS-ODNs抑制了CIP所诱导的海马CA1区锥体神经元抗脑缺血打击的耐受性。结论:侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs可抑制CIP诱导的大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达的上调,同时抑制了CIP所诱导的海马CA1区锥体神经元抗损伤性脑缺血的耐受性,表明CIP通过上调GLT-1a的表达诱导脑缺血耐受。