【摘 要】
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静息巯基氧化酶QSOX家族成员属于一类FAD结合的巯基氧化酶,它们作为一种二硫键形成酶对细胞内很多蛋白的氧化折叠起到至关重要的作用。本文对人源重组的QSOX蛋白(HsQSOX蛋白)
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静息巯基氧化酶QSOX家族成员属于一类FAD结合的巯基氧化酶,它们作为一种二硫键形成酶对细胞内很多蛋白的氧化折叠起到至关重要的作用。本文对人源重组的QSOX蛋白(HsQSOX蛋白)的结构和功能进行了一系列的研究。在对全长蛋白HQSOX(30-604)研究的基础上通过参阅文献报道的HsQSOX蛋白的二级结构、氨基酸序列和结构域信息,利用分子生物学的方法进行了一系列截短质粒的构建,并在大肠杆菌中进行了这些截短蛋白的表达纯化和对TCEP、DTT和rRNase三种还原性底物的氧化活性检测,最终确认了对TCEP具有氧化活性的最小结构域蛋白是HQSOX(295-536),并论证了HsQSOX各结构域缺失对该蛋白的氧化活性的影响。
为了检测体内条件下HsQSOX的催化功能,可用挠足虫荧光素酶(gaussialuciferase)Gluc作为其氧化巯基的探针。Gluc蛋白含有9个半胱氨酸,在完全被氧化的情况下能形成四对二硫键,但Gluc蛋白的二硫键只有在被氧化时才有活性,因此,它的活性功能发挥的好坏直接证明了HsQSOX氧化Gluc蛋白的巯基的程度,但在活体中gaussia luciferase蛋白在底物作用下发射出的蓝光不易透过细胞膜,因此需要利用BRET和FRET技术将其发出的光转化成易透膜的红光,间接反应出细胞中的发光,从而也反应出HsQSOX蛋白的催化功能。本文利用Gluc、mKO2、mCherry三种蛋白的性质和功能,通过点突变获得发光时间延长的Gluc突变蛋白,并通过构建一系列不同长度linker的融合蛋白质粒,将之转化到大肠杆菌中进行小量表达,在菌体破碎后的上清液中进行BRET和FRET现象的研究,最终获得了FRET现象明显的融合蛋白,为体内检测HsQSOX和Gluc蛋白的功能奠定了基础。
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