尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator receptor,uPAR)是一个高度糖基化的膜蛋白。成熟的uPAR缺乏跨膜结构,由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上。uPAR几乎在所有人类肿瘤中表达,其高表达与增强肿瘤的增殖、迁移和侵袭呈正相关。uPAR在多种肿瘤内高表达是影响预后的不良因素。多数研究表明,下调uPAR可以抑制细胞的迁移和侵袭。但是,uPAR对于胞内信号改变的影响的研究相对较少。本文探讨了 uPAR下调后,对于细胞内凋亡通路的影响。我们的实验发现,uPAR稳定干扰细胞系HCT116 antisenseuPAR(AS-uPAR)与其对照HCT116 mock(Mock)相比,自发性细胞凋亡没有显著差异。然而在加入细胞凋亡诱导剂TRAIL(Tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)后,发现uPAR下调能够显著增强细胞对凋亡诱导的敏感性。TRAIL是一个非常有前景的抗肿瘤药,它可以选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡而对大部分正常细胞没有影响,在临床Ⅰ-Ⅲ期试验上TRAIL同样具有杰出的表现。然而随着深入的研究发现,也有很多肿瘤细胞对于TRAIL的敏感性不强。因此寻找增强TRAIL敏感性的策略,就越来越吸引了众多研究者的目光。鉴于uPAR下调能够明显增强TRAIL敏感性的现象,我们进一步的研究了导致这一现象的原因。通过对TRAIL诱导细胞凋亡通路相关的关键蛋白的检测,我们发现:1.uPAR下调后,死亡受体通路蛋白DR4、DR5、Caspase-8以及Caspase-3的蛋白水平没有改变;2.在线粒体细胞凋亡通路上关键蛋白以促进凋亡发生的方式发生改变,这些蛋白包括p53、Bcl-2、Bid、Bax等。进一步干扰p53蛋白表达能够逆转uPAR下调增强TRAIL敏感性的这一潜能,说明p53在这一过程中至关重要。我们还发现,当uPAR下调后,黏着斑激酶(FAK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化程度都显著下降。进一步实验表明,JNK的磷酸化变化与p53上调关系密切,JNK磷酸化能够负调控p53表达。uPAR下调介导的TRAIL凋亡敏感性增强,是一个依赖于细胞色素c释放以及Caspase激活的过程。uPAR能够与其配体尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator,uPA)高度亲合并使其激活,由此调节细胞表面蛋白水解酶的活性、从而促进细胞外基质的水解及细胞的粘附和侵袭。此外,研究还表明在肿瘤细胞中,uPAR也可以与其它膜蛋白或跨膜受体相结合,包括整合素、G蛋白偶联受体、生长因子受体等,这些相互作用对于uPAR信号向细胞内传递以及调控肿瘤发生过程具有关键的作用。因此,寻找与uPAR相互作用的新蛋白,对于研究其在肿瘤调控中的作用至关重要。在我们前期的研究中通过酵母双杂交实验筛选到了多个胞内蛋白能够与uPAR相互作用,其中包括Sproutyl(SPRY1)。基于前期研究,本课题进一步研究了 SPRY1与uPAR相互作用对细胞粘附、生长的影响及其机理。首先,我们验证了 SPRY1及uPAR能够共定位于细胞质中。免疫荧光共定位结果显示:SPRY1与uPAR在胞质中存在共定位现象,外源过表达SPRY1及uPAR具有与内源蛋白相同的定位。我们紧接着探讨了 SPRY1对uPAR介导的细胞粘附功能的影响。我们发现,在SPRY1低表达细胞系HCT116以及A549细胞中过表达SPRY1能够显著抑制细胞对vitronectin的粘附。进一步,我们在HEK293(uPAR-/-)及293-uPAR(uPAR+/+)细胞中,验证了 SPRY1对uPAR介导的粘附功能的影响。在293-uPAR细胞中,SPRY1过表达能够显著抑制该细胞对于vitronectin的粘附;然而在野生型293细胞中,SPRY1表达的上调与细胞对vitronection的粘附并没有显著影响。流式细胞仪检测发现,在293-uPAR细胞中,过表达SPRY1能够使细胞表面uPAR蛋白量显著减少。Westem Blot检测显示,SPRY1能显著下调uPAR蛋白表达。我们进一步的研究发现,在HCT116、A549和293-uPAR细胞中,SPRY1过表达对uPAR mRNA没有影响,但是能够显著降低uPAR蛋白的表达水平。目前认为SPRY家族蛋白为磷酸化蛋白,生长因子等胞外信号刺激时会使其磷酸化,从而抑制受体酪氨酸激酶途径。我们发现,在293-uPAR细胞中,转染不同量的SPRY1能够按浓度依赖性地下调uPAR水平,而这种下调不受SPRY1的磷酸化的影响。我们使用两种蛋白降解途径抑制剂研究发现:蛋白酶体抑制剂MG132不能改变SPRY1下调uPAR蛋白水平的现象,而溶酶体抑制剂E64则能够明显逆转uPAR的下调。因此,我们推测SPRY1能够抑制293-uPAR细胞对于vitronectin粘附的原因是:SPRY1促使uPAR通过蛋白酶体降解,从而使得细胞膜表面uPAR总量减少。MTT及实时细胞分析(RTCA)实验均表明:过表达SPRY1能够显著抑制肿瘤细胞HCT116和A549的生长。在肺癌A549细胞中,瞬时转染过表达载体pRK5-SPRY1,其生长速率显著低于转染空载体pRK5的细胞。在结肠癌细胞HCT116中,瞬时转染过表达载体SPRY1 48h后,也能够显著抑制细胞的增殖。进一步,在uPAR稳定干扰细胞AS-uPAR中,瞬时转染过表达载体SPRY1能使倍增时间延长17.1%,而在其对照Mock细胞中转染等量SPRY1却能使倍增时间延长了约50%。因此我们推测,SPRY1可能通过uPAR来抑制细胞的增殖。在体内背部原位肿瘤模型实验中,瘤体内注射过表达载体SPRY1与转染试剂混合物也证明,上调SPRY1后能显著抑制原位肿瘤的生长,从而达到肿瘤治疗的目的。关于SPRY1抑制细胞生长的机制,我们的初步证据显示,SPRY1能够抑制uPAR所介导的ERK活化。uPAR高表达使得ERK过度活化、从而加速了细胞有丝分裂进程,促进细胞增殖。在SPRY1本底水平较低的HCT116和A549细胞中,过表达SPRY1不仅本身能够抑制ERK通路的激活,而且能够抑制uPAR介导的FAK及ERK持续性激活。雷公藤内酯醇(Triptolide)是多年生卫矛科植物雷公藤(Tripterginum Wilfordii Hook.F)的主要活性成分之一,具有抗炎、抗肿瘤以及免疫抑制等多种活性,已经受到了全世界的关注。雷公藤内酯酮(Triptonide)和雷公藤内酯三醇(Triptriolide)同样是雷公藤的提取物,与雷公藤内酯醇结构相似,都属于二萜类三环氧内酯化合物。三种化合物具有很多的生物功能或细胞学毒性,但是它们作用的分子机制,特别是它们直接的作用靶点仍然不明确。在本论文中,我们发现雷公藤内酯醇能够浓度依赖性的抑制uPAR mRNA表达水平。这一结果提示,雷公藤极有可能通过靶向不用的作用蛋白来调控SPRY1 mRNA的表达水平。我们利用计算机反向模拟对接技术,将小分子化合物对接到多个核受体类蛋白(NRS)的活性位点上,筛选了其潜在的结合蛋白。通过对接,我们发现多个核受体蛋白具有潜在的结合可能,其中雌激素受体α(Estrogen Receptor α,ERα)相对评分最高。进一步实验,利用体外重组表达技术,我们将ERα配体结合域(ERα-LBD)在大肠杆菌中表达。利用两种无标记亲和力检测方法,即等温滴定量热(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)和表面等离子共振(Surface Plasma Resonance,SPR)实验方法,检测了三种小分子与ERα-LBD的结合情况。结果显示三种小分子与ERα-LBD都具有特异性的结合,但其结合属于弱相互作用。报告基因实验结果表明,在ER阴性HepG2细胞内,瞬时转染ER过表达质粒和含雌激素反应元件(Estrogen Response Element,ERE)的报告基因质粒ERE-luc后,与对照相比,雷公藤内酯醇和内酯酮能够显著诱导荧光素酶基因的表达。对SPRY1启动子的分析发现,其启动子含有雌激素受体反应原件序列。雷公藤内酯醇对SPRY1启动子介导的报告基因活性分析结果显示,雷公藤内酯醇能够显著的上调由SPRY1启动子介导的报告基因激活。这一结果进一步证实了雷公藤内酯醇极有可能与雌激素受体结合,从而调控SPYY1 mRNA的表达水平。