蛋白精氨酸甲基化转移酶1(Protein Arginine Methlytransferase 1,PRMT1)是蛋白精氨酸甲基转移酶家族的主要成员。PRMT1有多种组氨酸和非组氨酸底物,它通过甲基化这些底物调控蛋白-蛋白间和蛋白-核酸间的相互作用,发挥表观遗传转录调节、RNA剪接、RNA输出和信号传导功能。PRMT1通过甲基化Runt相关转录因子1(Runt-related Transcription Factor 1,RUNX1)激活转录调节造血。在AML1-ETO的急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)中,PRMT1与AML1-ETO相互作用,敲低PRMT1的表达能减少由AML1-ETO激活的相关基因表达,减少白血病细胞的增殖并抑制它们的自我更新。PRMT1在新诊断出的儿童急性淋巴细胞白血病患者中的表达显著增高。RNA结合蛋白15(RNA Binding Motif Protein 15,RBM15)是由位于1号染色体的上的RBM15/OTT基因编码的RNA结合蛋白。它能与核RNA输出因子1(Nuclear RNA export factor 1,NXF1)相结合并直接识别RNA输出元素(RNA Transport Element,RTE),辅助输出含有RTE的基因,促进基因的表达,参与输出通路发挥核输出功能。RBM15与c-Myc结合调节成人造血干细胞向巨核细胞分化。在RBM15基因敲除的成年小鼠中髓细胞及巨核细胞增生异常,并且由于在前B细胞的分化阶段受到阻滞,导致使外周B细胞缺失。我们的前期研究结果发现PRMT1甲基化RBM15蛋白的R578位点,导致甲基化的RBM15蛋白经过E3连接酶介导的泛素化降解,RBM15直接与RUNX1和GATA1的pre-mRNA的内含子区域结合后与SF3B1作用调控它们的RNA可变剪接。但是PRMT1-RBM15在正常造血干细胞向巨核细胞及髓系细胞分化过程中的作用机制仍不清楚。众多研究发现许多造血系统疾病发生表观遗传调控异常和RNA剪切功能的异常。骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndrome,MDS)是一组异质的克隆性干细胞疾病。它的特征是至少一个造血谱系的发育不良和无效造血,且具有发展为急性髓系白血病的危险。基因测序结果显示大约80%的MDS患者携带基因突变,例如表观遗传调节基因(TET2,ASXL1,DNMT3A,IDH1,IDH2,EZH2),转录因子(ETV6,RUNX1,TP53),信号传导蛋白(CBL,JAK2,KRAS,NRAS)和与RNA剪接机制相关的基因(SF3B1,SRSF2,U2AF1,ZRSR2)。80%以上的MDS亚型环形铁粒幼细胞性贫血的患者发生剪切因子3b亚型1(Splicing Factor 3b Subunit 1,SF3B1)的基因突变。SF3B1K700E是SF3B1突变最常见的突变位点。SF3B1的突变如何导致红细胞生成缺陷的分子机制仍不清楚。RBM15的RIP-seq分析显示,RBM15与SF3B1和TAL1的内含子区域相结合。TAL1基因编码一个具有螺旋-环-螺旋结构的转录因子,是在造血过程的关键转录因子。它对早期造血和成人造血中红细胞和巨核细胞生成有重要作用。TAL1基因有多个启动子,可编码产生全长的TAL1(TAL1 full-length,TAL1fl)蛋白及短的TAL1(TAL1 short-form,TAL1s)蛋白。此外,TAL1fl mRNA可通过使用在N-末端区域部分的不同翻译起始位点产生不同大小的蛋白质。TAL1s的N末端没有DNA结合域,TAL1s的过表达促进了小鼠骨髓细胞的红细胞分化。所以我们推测PRMT1-RBM15、SF3B1和TAL1之间的相互作用的失调可能在MDS的发病机制中发挥关键作用。本研究第二部分中我们重点阐述了PRMT1-RBM15、SF3B1和TAL1之间的关系。急性巨核细胞白血病(Acute Megakaryoblastic Leukemia,AMKL)中t(1;22)(p13;q13)染色体易位比较常见,这种易位使得1号染色体上RBM15基因和22号染色体上MKL1基因形成融合基因RBM15-MKL1(又叫OTT-MAL)。RBM15和MKL1都是巨核细胞分化的重要基因,RBM15-MKL1融合基因导入的小鼠可以发生像RBM15敲除小鼠一样的巨核细胞分化缺陷。虽然RBM15-AMKL转基因小鼠AMKL的发病率很低,但是当将骨髓增殖白血病基因的突变体(Myloproliferative Leukemia virus mutant,MPLW515L)转入RBM15-MKL1骨髓后,它的AMKL的发病率为100%。6133细胞系是从RBM15-MKL1转基因的小鼠脾脏分离出来的细胞系,它的存活需要依赖干细胞因子(Stem Cell Factor,SCF)。我们前期实验证实了在6133细胞里过表达MPLW515L时激活了PRMT1的表达,并能够使6133细胞呈现无依赖因子的生长。生物信息技术分析发现,PRMT1在急性巨核细胞白血病中表达增高。DB75已经在不同的生物系统被用作研究PRMT1的功能,它能透过293T细胞的细胞膜并抑制PRMT1的活性。我们前期研究发现PRMT1抑制剂DB75能够促进造血干细胞向巨核细胞分化成熟,并且能逆转PRMT1导致的巨核细胞分化障碍。在正在培养的白血病细胞MEG01细胞的培养基中加入20μM的DB75,72h后显著抑制了它们的生长。但是RBM15-MKL1融合基因导致的白血病是否也具有PRMT1表达增高的特性,以及抑制PRMT1的活性能否抑制白血病的异常增殖需要我们进一步研究。综上所述,本研究主要从三个部分探讨PRMT1-RBM15调控通路在正常造血调控和疾病中的作用机制。第一,PRMT1-RBM15调控通路在正常红系及巨核系细胞分化过程中的作用机制;第二,PRMT1-RBM15调控通路在SF3B1K700E突变相关红系异常造血中的作用机制;第三,PRMT1-RBM15调控通路在RBM15-MKL1融合基因相关AMKL中的作用机制。此研究的目的旨在探讨PRMT1-RBM15调控通路是否能够作为治疗相关造血系统疾病的潜在靶点。第一部分:PRMT1-RBM15调控通路在正常红系和巨核系分化过程中的作用机制研究目的以正常脐血干细胞为研究对象,研究PRMT1-RBM15调控通路在正常造血干细胞向巨核细胞及红细胞分化过程中的作用。研究方法收集正常孕妇胎儿脐血,肝素抗凝,应用淋巴细胞分离液分选出单个核细胞,用磁珠分选仪分离脐血CD34+细胞。用磷酸钙包装病毒的方法分别包装PRMT1,RBM15,shPRMT1,shRBM15#1,shRBM15#2慢病毒,用PEG6000的方法把这些病毒浓缩为原体积的1/100。用这些病毒按照常规侵染悬浮细胞的方法分别侵染CD34+细胞。侵染48h后,用流式细胞学的方法或者用嘌呤霉素获得阳性细胞,并把这些阳性细胞分别在2IU/ml的EPO和50ng/ml的TPO的培养基中培养,7天后应用流式细胞学方法分别检测代表红细胞生成的表面抗原CD71和代表成熟巨核细胞表面抗原CD41,CD42的表达。研究结果1.PRMT1-RBM15调控通路调控着造血干细胞向巨核细胞分化。在CD34+脐血干细胞中过表达RBM15或者用PRMT1抑制剂(DB75)抑制PRMT1活性时,生成的成熟巨核细胞的数目增多;过表达PRMT1或者用shRNA的方法敲低RBM15时,生成的成熟巨核细胞的数目减少。2.PRMT1-RBM15调控通路调控着造血干细胞向红细胞分化。在CD34+脐血干细胞中过表达PRMT1或者用shRNA的方法敲低RBM15时,生成的红细胞增多;过表达RBM15或者用PRMT1抑制剂(DB75)抑制PRMT1活性时,生成的红细胞减少。第二部分:PRMT1-RBM15调控通路在SF3B1K700E突变相关红系异常造血中的作用机制研究研究目的研究PRMT1-RBM15调控通路在SF3B1K700E引起的骨髓增生异常综合征中的作用机制。研究方法1.用Real-time PCR及Western Blot的方法分析PRMT1-RBM15调控通路的改变是否影响TAL1两种异构体的表达。2.构建Flag-TAL1s,Flag-TAL1fl慢病毒质粒,用慢病毒原液侵染K562细胞,48h后,用流式细胞仪分选出阳性细胞。提取这些阳性细胞的RNA,反转录为c DNA,Real-time PCR的方法分析内源性的TAL1s、TAL1fl、ALAS2、β-globin和γ-globin的表达。用Benzidine染料分别对上述的阳性细胞进行染色,显微镜计数经Benzidine染色的阳性细胞,了解红细胞比例。构建TAL1s,TAL1fl的慢病毒质粒,用磷酸钙的方法包装病毒,用PEG6000的方法把病毒按照1:100的比例浓缩。用浓缩后的病毒按照侵染悬浮细胞的方法侵染人类脐血CD34+细胞。48h后,用流式细胞仪分选出病毒侵染阳性细胞,并分别把这些阳性细胞培养在含有2IU/ml的EPO的培养基中,7天后流式细胞学检测代表红细胞生成的表面抗原CD71的表达。3.用磷酸钙的方法分别将Flag-TAL1s、Flag-TAL1fl、Flag-TAL1s+ETO2、Flag-TAL1fl+ETO2转入293T细胞中,48h后收取总蛋白,免疫共沉淀纯化出Flag蛋白后用Western Blot的的方法检测ETO2的表达。分别收取在K562细胞中过表达Flag-TAL1s,Flag-TAL1fl的阳性细胞的总蛋白,用上述同样的方法检测检测ETO2的表达。4.野生型Flag-SF3B1和突变型SF3B1K700E慢病毒质粒来自美国Sloan-Kettering癌症中心,提取质粒,送金唯智测序公司测序。测序正确后,用磷酸钙的方法包装慢病毒,用病毒原液侵染K562细胞,48h后,用流式细胞仪分选出病毒侵染阳性细胞,收取细胞的总蛋白,免疫共沉淀的方法纯化出Flag蛋白,用Western Blot的方法分析RBM15的表达。研究结果1.PRMT1-RBM15调控通路调控着TAL1的可变剪接。PRMT1的表达增高或者用shRNA的方法使RBM15的表达敲低时,TAL1s/TAL1fl的mRNA比率和蛋白比率增高,产生的TAL1s增多。RBM15的表达增高和用shRNA敲低PRMT1的表达或者用PRMT抑制剂DB75使PRMT1活性减低时,TAL1s/TAL1fl的mRNA比率和蛋白比率减低,产生的TAL1fl增多。2.TAL1s能促进红细胞的成熟分化。当Flag-TAL1s和Flag-TAL1fl在K562细胞中过表达时,它们的细胞沉淀变红;与TAL1fl过表达的K562细胞相比,TAL1s过表达的K562细胞细胞沉淀变得更红。Real-time PCR分析显示TAL1s的表达增高没有使内源性的TAL1s或TAL1fl的mRNA水平增高,但是TAL1fl的表达增高使内源性的TAL1fl增高,而内源性的TAL1s增高并不明显。TAL1s的表达增高促进K562细胞产生更多的β-globin的mRNA,TAL1fl和TAL1s激活了负责血红素生成基因ALAS2的转录。TAL1s过表达的K562细胞经Benzidine染色的阳性细胞比例高于TAL1fl过表达K562细胞的阳性细胞比例。虽然在脐血干细胞中过表达TAL1s和TAL1fl都能使红细胞生成增多,但是TAL1s能更有效地生成更多的红细胞。同样在脐血干细胞中过表达PRMT1也能使造血干细胞产生更多的CD71红细胞。3.TAL1两种异构体与转录抑制因子ETO2的结合不同。不管是在293T细胞中或者在K562细胞中,TAL1fl与ETO2相互结合,但是TAL1s不与ETO2结合。有文献指出ETO2抑制红系发育,所以TAL1s通过不与ETO2结合促进红系发育。4.SF3B1K700E突变体与RBM15的相互作用增强影响TAL1的mRNA可变剪接。与野生型的SF3B1相比,RBM15与突变型的SF3B1结合增多。突变体SF3B1使TAL1fl的mRNA水平增高更多进而使TAL1s/TAL1fl的mRNA比率减少。野生型的SF3B1使血红蛋白生成相关基因ALAS2、γ-globin和β-globin的mRNA水平增高,但是SF3B1突变体不增加它们的mRNA水平。第三部分:PRMT1-RBM15调控通路在RBM15-MKL1融合基因相关AMKL中的作用机制研究研究目的研究PRMT1-RBM15调控通路在RBM15-MKL1融合基因导致的急性巨核细胞白血病中的作用机制。研究方法1.按照第二部分中分离脐血CD34+细胞的方法分离脐血CD34+细胞,用磷酸钙包装病毒的方法包装RBM15-MKL1和MPLW515L慢病毒,PEG6000的方法把病毒原液浓缩为原体积1/100。用常规侵染悬浮细胞的方法分别用RBM15-MKL1,RBM15-MKL1+MPLW515L,MPLW515L慢病毒侵染CD34+细胞。48h后,用流式细胞仪分选出阳性或双阳性的细胞。1)培养在CD34+细胞成长的培养基中,每天细胞计数;2)利用细胞克隆分析试剂盒做细胞连续克隆形成分析;3)培养在巨核细胞分化培养基中,7天后使用流式细胞学方法分析细胞表面CD41 CD42的表达。4)Real-time PCR方法分析PRMT1的mRNA水平,流式细胞学方法分析PRMT1蛋白水平。3.在1中分选的过表达RBM15-MKL1+MPLW515L的双阳性细胞中加入PRMT1抑制剂DB75。1)应用细胞活性分析试剂盒分析DB75对细胞活性的影响;2)利用细胞克隆试剂盒做细胞连续克隆形成分析;3)培养在巨核细胞培养基中并在7天后使用流式细胞学方法分析细胞表面CD41 CD42的表达。研究结果1.RBM15-MKL1融合蛋白和MPLW515L突变体共同作用能使脐血干细胞长期增殖。当RBM15-MKL1和MPLW515L共同表达在脐血CD34+细胞时能够在造血干细胞培养基中长期存活,并且能够在含有CD34+细胞成长的细胞因子混合物的甲基纤维素的培养基中长期增殖。RBM15-MKL1+MPLW515L共同表达抑制了造血干细胞向巨核细胞分化。不管是mRNA或者是蛋白水平,PRMT1在RBM15-MKL1和MPLW515L共同表达的脐血CD34+细胞中都增高。2.PRMT1抑制剂DB75能抑制RBM15-MKL1+MPLW515L转化的CD34+细胞的增殖。当我们在RBM15-MKL1+MPLW515L共同表达的细胞加入DB75时,这些细胞在三天内停止生长并死亡。DB75能使RBM15-MKL1+MPLW515L共同表达的细胞在甲基纤维素培养基中培养时,细胞克隆形成停止。PRMT1抑制剂DB75能够逆转RBM15-MKL1和MPLW515L导致的白血病模型的巨核细胞成熟障碍,使成熟巨核细胞数目增多。研究结论1.PRMT1-RBM15调控通路在正常造血干细胞向巨核细胞及红细胞分化的过程中具有重要的调控作用。2.在SF3B1K700E突变的骨髓增生异常综合征中,RBM15与SF3B1K700E的结合增强,导致TAL1s的减少从而引起红细胞成熟分化减少。PRMT1的增高引起TAL1s的增加引起与红细胞成熟分化相关的基因ALAS2,β-globin的表达增高,从而导致红细胞数目增多。TAL1s促进红细胞成熟分化的原因是由与它失去了与转录抑制因子ETO2结合。3.PRMT1促进了RBM15-MKL1从造血干细胞向白血病细胞的转化作用。PRMT1抑制剂DB75能够逆转RBM15-MKL1导致的这种转化现象,促进了造血干细胞向巨核细胞分化。PRMT1抑制剂可能会成为治疗RBM15-MKL1引起的AMKL新的靶向药物。