第一部分声预处理对急性声损伤的保护作用及耳蜗形态学改变的影响目的:通过建立声预处理和急性声损伤SD大鼠动物模型,明确声预处理对大鼠听力的保护作用及其对急性声损伤所致耳蜗组织细胞结构变化的影响。方法:将20只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠按照完全随机分组的原则,分为四组即:正常对照组(Ctrl,5只)、声预处理组(SC,5只)、噪声暴露组(NE,5只)和声预处理+噪声暴露组(SC+NE,5只)。其中噪声暴露组给予声强为115d B SPL白噪声每天6小时,连续两天;声预处理组给予声强为85d B SPL纯音500Hz 24小时;声预处理+噪声暴露组则在先后给予声预处理和噪声暴露之间休息3小时;正常对照组不给予任何噪声接触,但其他方面均与造模组相同。于造模前以及造模后1天,分别采用ABR听性脑干反应(auditory brainstem response)检测SD大鼠双耳听觉反应阈值,在听觉功能上观察声预处理和噪声暴露对大鼠听力的影响。遂后采用基底膜铺片鬼笔环肽染色激光共聚焦和扫描电镜观察不同组SD大鼠耳蜗各转毛细胞形态变化,在形态学上证实声预处理和噪声暴露对SD大鼠耳蜗外毛细胞结构的影响;同时常规透射电镜观察各组大鼠耳蜗轴螺旋神经元细胞超微结构变化,在形态学上证实声预处理和噪声暴露对SD大鼠耳蜗螺旋神经元细胞线粒体结构的影响。结果:听觉脑干诱发电位(ABR)Click声和纯音检测听力阈值,结果均显示噪声暴露前给予声预处理的大鼠听阈明显低于单纯噪声暴露的大鼠听阈,且两者听阈差异具有统计学意义(P<0.05),而造模后声预处理组和正常组两者听阈在统计学上未见明显差异(P>0.05)。基底膜铺片鬼笔环肽染色和扫描电镜均证实了声预处理对各转三排外毛细胞功能性的结构重塑,即:底转三排外毛细胞结构完整,纤毛变短变粗且方向一致;中转、顶转三排外毛细胞纤毛极性消失,排列不齐且松散,有少量出现纤毛排列紊乱,但无明显纤毛倒伏、融合和消失;并且与单纯噪声暴露相比,噪声暴露前给予声预处理其各转三排外毛细胞缺失明显减少,外毛细胞纤毛变短但排列尚整齐,无明显纤毛倒伏、融合和消失;外毛细胞计数表明噪声暴露前给予声预处理在底转、中转外毛细胞缺失率上明显低于单纯噪声暴露,且两者差异均具有统计学意义(P<0.05),但两者在顶转外毛细胞缺失率未见明显统计学差异(P>0.05)。另外,透射电镜观察证实声预处理后耳蜗轴螺旋神经元细胞结构正常,线粒体数量有所增加,线粒体內嵴电子密度增高,内嵴间隙明显变窄;而噪声暴露后耳蜗轴螺旋神经元细胞皱缩,与鞘膜出现分离,线粒体肿胀变形且数量减少,內嵴电子密度降低,出现断裂、融合、消失,內嵴间隙明显增宽,大量空泡形成;同时较单纯噪声暴露,噪声暴露前给予声预处理其耳蜗轴螺旋神经元细胞皱缩和分离不明显,线粒体无明显肿胀变形,內嵴结构完整且电子密度增高,内嵴间隙明显变窄,未见內嵴断裂、融合、消失,偶有空泡形成。同时,耳蜗螺旋神经元细胞线粒体计数表明噪声暴露后螺旋神经元细胞线粒体密度明显减小(P<0.05),而声预处理后螺旋神经元细胞线粒体密度有明显增加(P<0.05)。结论:声预处理对大鼠急性声损伤有一定的听力保护作用,且对大鼠听力无明显损伤。在形态学上,声预处理对噪声暴露所致大鼠底转、中转外毛细胞损伤有一定保护作用;但对大鼠顶转外毛细胞损伤保护作用不明显。另外,噪声暴露破坏了线粒体的结构,对螺旋神经元细胞线粒体功能有明显损伤作用,而声预处理可明显提高线粒体的数量和功能状态,在一定程度上抑制了噪声暴露对螺旋神经元细胞线粒体的损伤和破坏。第二部分声预处理保护作用分子机制的在体研究目的:阐明声预处理通过调节螺旋神经元细胞线粒体结构和提高线粒体功能状态发挥保护作用的可能分子机制,从而指导临床急性声损伤的声预处理治疗,并提供新的思路和理论支持。方法:将80只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠按照完全随机分组的原则,分为四组即:正常对照组(Ctrl,20只)、声预处理组(SC,20只)、噪声暴露组(NE,20只)和声预处理+噪声暴露组(SC+NE,20只)。其中噪声暴露组给予声强为115d B SPL白噪声每天6小时,连续两天;声预处理组给予声强为85d B SPL纯音500Hz 24小时;声预处理+噪声暴露组则在前后给予声预处理和噪声暴露之间休息3小时;正常对照组不给予任何噪声接触,但其他方面均与造模组相同。造模后采用RT-PCR、免疫荧光染色和Western blot蛋白印迹方法分别检测各组SD大鼠Hsp70、Bmi1、SOD1、SOD2 m RNA和蛋白表达以及AKT蛋白磷酸化水平变化。结果:免疫荧光染色和Western blot蛋白印迹结果显示:Hsp70蛋白在正常螺旋神经节细胞(包括螺旋神经元细胞和支持细胞)中均有一定程度表达;噪声暴露降低了螺旋神经元细胞Hsp70蛋白表达,但其周围的支持细胞可以部分代偿性维持Hsp70蛋白表达;而声预处理能明显提高螺旋神经元细胞Hsp70蛋白表达,在一定程度上抑制了噪声暴露对螺旋神经元细胞Hsp70蛋白表达的下调。而Bmi1蛋白在正常螺旋神经节细胞(包括螺旋神经元细胞和支持细胞)中亦均有一定程度表达,噪声暴露降低了螺旋神经元细胞Bmi1蛋白表达,但其周围的支持细胞却代偿性提高Bmi1蛋白表达;而声预处理亦能明显提高螺旋神经节细胞Bmi1蛋白表达并转位于线粒体内,在一定程度上可以抑制噪声暴露对螺旋神经元细胞Bmi1蛋白表达的下调,这与Hsp70表达具有时间和空间上的一致性。另外,SOD1、SOD2蛋白在正常螺旋神经节细胞(包括螺旋神经元细胞和支持细胞)中亦均有一定程度表达;噪声暴露降低了螺旋神经元细胞和支持细胞SOD1、SOD2蛋白表达;而声预处理亦能明显提高螺旋神经节细胞SOD1、SOD2蛋白表达,在一定程度上可以抑制噪声暴露对螺旋神经节细胞SOD1、SOD2蛋白表达的下调。同时RT-PCR结果显示:较正常对照组,声预处理组螺旋神经节细胞Hsp70、Bmi1、SOD1和SOD2 m RNA表达均明显提高。结论:声预处理诱导上调螺旋神经元细胞Hsp70 m RNA和蛋白表达,增强了神经元细胞自身的保护性应激反应;同时螺旋神经元细胞Bmi1、SOD1和SOD2的m RNA和蛋白表达的上调及Bmi1蛋白的线粒体转位也参与了声预处理对噪声暴露所致急性声损伤的保护作用,其中诱导抗氧化基因SOD1和SOD2蛋白表达上调与Hsp70和Bmi1蛋白表达上调均具有时间和空间上的一致性。第三部分相关分子机制的体外研究目的:为进一步证实声预处理可能激活的分子调控机制,阐明螺旋神经元细胞抗氧化基因SOD1和SOD2可能是Hsp70和Bmi1的下游调控分子靶点。方法:新生SD大鼠仔鼠耳蜗螺旋神经元细胞取材培养1天后,完全随机分为:正常对照组和Bmi1抑制剂组,其中正常对照组除按需更换细胞培养液外加入与抑制剂组相同体积的DMSO溶液,而Bmi1抑制剂组除按需更换细胞培养液外加入1μM PTC-209溶液(DMSO为溶剂);培养两天后细胞爬片免疫荧光染色并荧光显微镜观察各组体外培养大鼠螺旋神经元细胞Bmi1、SOD1、SOD2和Hsp70的表达变化。结果:Bmi1高选择性抑制剂PTC-209与新生大鼠螺旋神经元细胞体外共培养,免疫荧光染色观察,结果显示:在PTC-209抑制剂有效抑制Bmi1蛋白表达的前提下,与正常螺旋神经元细胞相比,其胞体内红色荧光标记的SOD1和SOD2表达均显著减少,而其胞体內Hsp70蛋白仍为弱阳性表达;这表明大鼠螺旋神经元细胞Bmi1正性调控了SOD1和SOD2蛋白的表达,但并不调控Hsp70蛋白表达。结论:螺旋神经元细胞抗氧化基因SOD1和SOD2可能是Bmi1的下游调控分子靶点。