一.研究背景目前认为,支气管哮喘是一种由多种细胞、炎性介质和细胞因子所介导的具有复杂免疫机制的气道慢性炎症性疾病。主要表现为气道内嗜酸性粒细胞浸润、粘液分泌增多以及对外来吸入性过敏原和非特异性刺激的气道反应性增高。哮喘时气流阻塞可为可逆、部分不可逆甚至完全不可逆,导致临床表现复杂多变,增加了治疗的难度,并影响疾病的转归。目前普遍认为,其主要成因在于气道的持续性损伤以及结构改变,即气道重塑(或者气道重构)。这些改变包括气道壁增厚,上皮损伤和上皮细胞增生,上皮下纤维化,杯状细胞化生和黏液转化,肌纤维母细胞增生和肌细胞增生与肥大,血管异常,基质蛋白沉积及腺体增生肥大等。目前普遍认为气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell, ASMC)的增殖在哮喘气道重构中占有十分重要的地位,并与气道的高反应性以及药物疗效密切相关。遗憾的是,目前国内外通用的哮喘诊治方案,均强调对气道炎症的控制,而对气道重塑重视不够,而且现行的治疗方法还不能有效的阻止甚至逆转气道重塑的发生和发展。近年ASMC已成为哮喘研究的一个新热点,越来越多的研究学者提出应把ASMC作为支气管哮喘研究和治疗的标靶。10号染色体上磷酸酶与张力蛋白同源缺失性基因PTEN (phosphase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN)亦称MMAC1基因(mutated in multiply advanced cancer 1,多种晚期癌症中发生突变的基因,或者多发性进展期癌症突变基因)或TEP-1基因(TGF-β1 regulated and epithelial cell-riched phosphatase 1,由TGF-β1调控并在上皮细胞中高度表达的磷酸酶),定位于10q23.3,是迄今发现的首个具有双重特异性磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,在细胞的生长发育、凋亡、迁移、信号传递等方面起着重要的调控作用。已有的研究发现在人类多种肿瘤中,如前列腺癌、胶质瘤、乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌等,都存在PTEN基因的改变。随着研究的深入,人们也发现其在非肿瘤性疾病,如：心肌肥大、高血压动脉粥样硬化、支气管哮喘、肾纤维化以及缺血性脑中风等疾病中也发挥了重要的作用。PTEN基因能够编码由403个氨基酸组成的蛋白质,在维持正常细胞的稳定性中发挥着重要的作用。PTEN蛋白通过其双重底物特异性磷酸酶活性直接或间接地整合复杂的信号网络系统,主要是可以阻断磷脂酰肌醇-3-激酶信号传导通路(PI3K/PKB/AKT信号通路)及丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号传导通路(Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路),而这些通路同时也是介导ASMC增殖等功能的主要信号传导通路。因此,值得研究的是,PTEN是否能通过抑制PI3K/PKB/AKT和MAPK信号传导通路从而抑制人气道平滑肌细胞的增生、肥大,促进凋亡。故此我们推断,PTEN基因的过表达对气道平滑肌细胞可能具有抑制增殖的作用；相反,沉默PTEN基因的表达对气道平滑肌细胞则应该具有促进增殖的作用。二.研究目的通过将携带野生型PTEN cDNA的腺病毒载体(Ad-GFP-PTEN)和携带PTEN短发夹状RNA的腺病毒载体(Ad-GFP-shRNA-PTEN)分别转染体外培养的人气道平滑肌细胞(Airway Smooth Muscle Cell, ASMC),实现PTEN基因的过表达和RNA干扰,并以携带绿色荧光蛋白GFP的阴性对照腺病毒(Ad-GFP)转染组和只添加无血清培养基DMEM的空白组作为对照,初步研究PTEN基因表达的改变对ASMC增殖和相关信号通路的影响。三.材料和方法1、人气道平滑肌细胞(ASMC)的分离、培养与鉴定：分离肺叶切除术患者切除的正常肺叶、肺段支气管标本,按照相关文献报道和本实验室已经成熟的方法,采用组织块贴壁培养法进行人气道平滑肌细胞的培养,4～8代的气道平滑肌细胞用于实验。在倒置相差显微镜下观察细胞生长形态并用抗平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体(α-SM actin)行免疫细胞化学染色鉴定为人气道平滑肌细胞。2、实验分组：将实验细胞分为以下4组：①干扰组(Ad-GFP-shRNA-PTEN):应用腺病毒载体携带针对PTEN基因的短发夹状RNA (shRNA)以最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)=100体外转染ASMCs;②阴性对照组(Ad-GFP):应用腺病毒载体携带绿色荧光蛋白GFP以感染复数=100体外转染ASMCs;③空白对照组(DMEM):只添加无血清培养基DMEM体外培养ASMCs;④过表达组(Ad-GFP-PTEN):应用腺病毒载体携带野生型PTEN基因以感染复数=100体外转染ASMCs。3、重组腺病毒感染ASMC:选择处于对数生长期的ASMCs,加入用无血清的DMEM稀释的病毒液,置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中孵育,4h后补加含有血清的完全培养基,继续孵育24h后,更换完全培养基,通过在倒置荧光显微镜下观察病毒转染效果。4、MTS/PMS微量比色分析法检测PTEN基因表达改变后四组气道平滑肌细胞的生长状况。5、PI单染后流式细胞术测定PTEN基因表达改变后四组气道平滑肌细胞各自的细胞周期分布情况。6、Western blotting免疫印迹法检测四组气道平滑肌细胞的PTEN、p-Aktser473、p-ERK1/2、Total-Akt和Total-ERK1/2蛋白以及内参GAPDH的表达。7、所有原始数据用x±s表示,应用SPSS13.0软件进行One Way ANOVA统计学分析,组间比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。四.结果1、应用倒置相差显微镜在100×倍镜下观察,ASMCs未汇合之前多呈梭形或多边形,细胞汇合后部分区域的细胞成束状排列,呈典型“峰与谷”状。对平滑肌细胞特异的α-肌动蛋白(α-SM actin)进行免疫细胞化学染色,在400×高倍镜下可见α-SM actin在气道平滑肌细胞胞浆内均匀分布,呈棕色平行纤维丝状结构。传至第4代,平滑肌细胞纯度为95%。2、转染人ASMCs 48h后在倒置荧光显微镜下,可见重组腺病毒载体成功转染ASMC,满视野皆可见转染阳性的平滑肌细胞呈明显绿色荧光。3、Western blotting免疫印迹法检测PTEN蛋白的表达：成功转染腺病毒载体Ad-GFP-shRNA-PTEN后,干扰组细胞的PTEN蛋白表达减弱；转染腺病毒载体Ad-GFP-PTEN后,过表达组细胞的PTEN蛋白表达增强；而对于阴性对照组和空白对照组,PTEN蛋白的表达无明显变化。4、Western blotting免疫印迹法检测AKT蛋白的表达：与阴性对照组和空白对照组相比较,p-AKTser473在干扰组细胞中表达明显增多,而在过表达组细胞中表达显著减少。但四组细胞的total-Akt表达无明显差异。5、Western blotting免疫印迹法检测ERK1／2蛋白的表达：与阴性对照组和空白对照组相比较,p-ERK1/2在干扰组细胞中表达明显减少,在过表达组细胞中表达却无显著差异。但四组的total-ERK1/2表达无明显差异。6、MTS/PMS微量比色分析法检测显示,在PTEN基因表达改变后,与阴性对照组和空白对照组相比较,干扰组细胞生长明显增快(P<0.01),而过表达组生长明显受到抑制(P<0.01)。而干扰组与过表达组两者比较,细胞生长的差异更明显(P<0.001)。阴性对照组和空白对照组两者相比较,细胞生长的差异无统计学意义(P=1.000)。7、PI单染的流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布结果显示,转染腺病毒载体48h后,干扰组细胞大部份跃出G1期,进入S期的细胞比例明显增加；而过表达组Go-G1期细胞增多,S期细胞和G2／M期细胞则减少,细胞周期被阻滞于Go／G1期。干扰组细胞主要集中在S期,过表达组细胞主要集中在Go／G1期,与阴性对照组和空白对照组相比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。五.结论本实验研究通过采用基因过表达和RNA干扰技术,研究了改变肿瘤抑制基因PTEN的基因表达对气道平滑肌细胞ASMC增殖的影响,并初步探讨了PI3K-Akt和Ras/Raf/MEK/ERK两条信号传导通路的变化情况,通过研究我们得到了以下结论：1、与在其他类型细胞中的作用相似,改变PTEN基因的表达能够调节ASMC的增殖。外源性PTEN基因的过表达能够抑制ASMC的增殖和细胞周期进展,Go-G1期细胞的比例增多,而S期和G2／M期细胞的比例减少；相反,沉默PTEN基因的表达则能够促进ASMC的增殖和细胞周期进展,S期细胞和G2／M期细胞的比例增多,而Go-G1期的比例减少。2、在PTEN基因的参与下,PI3K-Akt和Ras/Raf/MEK/ERK两条信号传导通路之间发生相互联系或者串扰,即所谓的Cross-talk,表现为：沉默PTEN基因的表达后引起磷酸化激活Akt,后者最终能够抑制ERK1／2的磷酸化。这也同时表明,在PTEN基因调节气道平滑肌细胞ASMC增殖过程中,以PI3K-Akt信号通路的调节方式占优势。