白梭吻鲈又称为梭鲈(Sander lucioperca),属于鲈形目(Perciformes)、鲈科(Percidae),是一种极具养殖潜力的亚冷水性鱼类,夏季高温是导致养殖池塘中白梭吻鲈大量死亡的主要原因。为探究白梭吻鲈热应激机理、评价热刺激对白梭吻鲈的影响,本研究通过光镜及扫描电镜观察了热刺激下白梭吻鲈鳃组织损伤情况,测定了鳃中抗氧化酶及丙二醛含量;进行了热刺激下白梭吻鲈鳃组织转录组测序分析,筛选出热刺激引起的显著差异表达基因;检测了不同热刺激时间下白梭吻鲈鳃抗氧化酶基因及HSP家族基因表达量。以上研究结果丰富了白梭吻鲈热应激生理学研究基础数据。具体研究如下:1不同热刺激温度对白梭吻鲈鳃组织结构及抗氧化酶的影响将100尾鱼暴露于28℃、31℃、34℃、36℃热应激2h,以23℃作为对照组。收集鳃用于石蜡切片制备,并将苏木精伊红(HE)染色用于一般组织学观察。测定超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性和丙二醛(MDA)等抗氧化指标。结果显示:28℃组鳃小片发生充血,31℃组部分鳃小片末端卷曲变形、上皮细胞水肿,34℃组鳃小片变形加重,且有少量融合,上皮细胞水肿加重、明显隆起,鳃小片之间粘液细胞肥大、增生,36℃组相邻鳃小片大量融合且严重变形,卷曲混乱排列,大量上皮细胞坏死、脱落,鳃丝粘液细胞增生、肥大;随着刺激温度升高,鳃中SOD、CAT、GPX、MDA均整体呈现先升高、后降低的变化趋势,且在36℃时显著下降。这表明在热应激后,鱼体内ROS增加,脂质过氧化增加。由于体内产生大量的ROS和H202,机体也增加了 GPX和CAT的合成。当暴露在36℃时,热刺激强度超过白梭吻鲈的适应能力,抗氧化系统功能无法正常进行。表明热刺激对白梭吻鲈鳃组织有损伤,且随着热刺激温度的升高,其鳃受损情况越发严重。2不同热刺激时间对白梭吻鲈鳃组织的损伤以23℃为对照组,试验水温刚上升至30℃时作为Oh,分别在热刺激Oh、3h、6h、12h、24h、48h时采样,通过光镜及扫描电镜观察不同时间长度热刺激对白梭吻鲈鳃组织的损伤情况。结果显示:Oh和3h试验组可观察到鳃小片上皮细胞肿胀;24h试验组出现鳃小片弯曲变形;48h时可观察到明显的鳃小片融合现象。本研究发现在30℃热刺激Oh到48h范围内,鳃组织损伤程度随热刺激时间的延长而持续加重,到热刺激48h后,鳃组织出现Ⅱ级损伤,但尚未发现Ⅲ级损伤情况。3不同热刺激时间对白梭吻鲈鳃中抗氧化体系相关酶活性的影响试验材料同试验一,检测了不同时间热刺激下白梭吻鲈鳃中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽还原酶(GR)、总抗氧化能力(T-AOC)共六种酶的活性及丙二醛(MDA)的含量。结果显示白梭吻鲈鳃中T-SOD和CAT活力表现为先升高后下降的趋势。热刺激开始6h之内,随热刺激时间的延长,T-SOD的活力一直升高,6h时达到最大值,热刺激12h时,T-SOD活力有所降低,并在48h时低于对照组。CAT活力从3h时开始,与对照组有显著差异(P<0.05),在12h时达到最大值,随后下降至与对照组无显著差异水平(P>0.05)。白梭吻鲈鳃中GPX和GSH的活力变化趋势基本相似,分别在24h和12h达到最大值,且显著高于对照组(P<0.05),随后下降至与对照组无显著差异水平(P>0.05)。GR活力在12h和24h时,与对照组相比没有显著差异(P>0.05),其他时间点实验组GR活力均显著高于对照组(P<0.05)。白梭吻鲈鳃中MDA的含量随着刺激时间的延长而持续上升,48h时MDA的含量达到最大值。T-AOC活性仅在6h时与对照组有显著差异(P<0.05)。总之,白梭吻鲈鳃组织受到热刺激以后产生了氧化应激,且应激程度随时间延长而增加。4热刺激下白梭吻鲈鳃转录组分析以23℃为对照组,30℃热刺激6h为实验组,每组各取3尾鱼的鳃组织共6个样品进行转录组测序,共获得65.85Gb Clean Data,Q30碱基百分比在93.45%以上,组装后共获得59,275条Unigene。Nr功能注释结果显示共有3362条(18.01%)Unigene L比对上尖吻鲈(Lates calcarifer)功能基因序列,表明白梭吻鲈与尖吻鲈的亲缘关系较近。COG、GO和KEGG注释显示,分别有4797个、10798个、11305个unigene成功完成了 COG、GO和KEGG功能分类。差异表达基因筛选结果显示,与对照组相比,共252个基因在热应激下表达量显著变化,其中表达量上调的基因191个,下调的基因61个。共有15个差异表达基因成功进行了 KEGG通路分析。KEGG通路富集分析显示多条通路参与到白梭吻鲈热应激反应,其中参与脂质代谢的最多(6条),其次是氨基酸代谢(4条)和碳水化合物代谢(3条),另外有部分参与折叠、分类和降解等功能。从差异表达基因中选取6个基因进行荧光定量PCR验证,结果显示:HSC70、GATM、ATP-binding基因表达显著升高,CPS、HUNK、NHSL基因表达显著下降,6个差异基因表达变化与转录组测序变化趋势一致,表明本研究中的高通量测序结果较为可靠。5不同热刺激时间对白梭吻鲈鳃中抗氧化相关基因及HSP家族基因表达的影响试验材料同试验一,通过荧光定量PCR检测白梭吻鲈鳃中抗氧化相关基因及HSP家族基因在不同热刺激时间下的表达情况。结果显示Cu-Zn SOD和Mn SOD基因变化趋势基本相似,除6h组与对照组无显著差异外(P>0.05),其他试验组均显著高于对照组(P<0.05)。CAT基因在3h显著高于对照组(P<0.05),在48h上升到最大值。GPX1和GPX3基因在Oh时已显著高于对照组(P<0.05),而GPX7稍有延迟,在3h时才开始显著高于对照组(P<0.05),且随后变化不明显,在48h升至最大值。HSP90和HSC70基因表达虽然变化波动较大,但各试验组表达量均显著高于对照组(P<0.05)。HSP70基因表达量在6h时上升至最大值后开始下降,48h时低于对照组。