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研究背景和目的:H5、H6、H7、H9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）在水禽和陆禽中广泛流行和进化,部分病毒株甚至具有了识别和结合人型受体唾液酸（Sialic acid,SA）α-2,6半乳糖苷（Galactose,Gal）的能力,有进化演变成为感染人的可能。研究表明,禽流感病毒要实现有效感染人类,引起人际传播甚至大流行,病毒首先必须具备有与人型受体识别和结合的能力。炎症小体可以介导炎性细胞因子白细胞介素1β（Interleukin-1,IL-1β）和白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）的分泌,诱导固有免疫和适应性免疫,在机体的免疫炎症反应中具有重要作用。流感病毒感染可以激活多种炎症小体,具有抗病毒作用,同时,炎症小体又是诱发“细胞因子风暴”、引起免疫炎症损伤的重要原因。与其它炎症小体不同,含PYRIN结构域NLR家族蛋白3（NLR family pyrin domain–containing protein 3,NLRP3）炎症小体可被多种刺激所激活,包括病原体感染和内源性危险信号分子,被认为是多种炎症反应的活化中心,但流感病毒感染人呼吸道是否能激活NLRP3炎症小体尚未清楚。因此,本研究首先筛选具有结合人型受体能力的禽流感病毒,然后接种于原代人肺组织和人支气管组织以及人肺上皮细胞来源的传代细胞A549、人支气管上皮细胞来源的传代细胞BEAS-2B,观察该类病毒在人呼吸道的复制能力,最后检测该类病毒与人流感病毒在体外人呼吸道组织诱导的NLRP3炎症小体成分NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）及下游通路蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1）、Gasdermin D（GSDMD）、IL-1β和IL-18的表达,初步探讨流感病毒诱导人呼吸道组织NLRP3炎症小体的激活。方法:1.实验毒株的选择和扩增:选择5株禽源流感病毒H9N2亚型禽流感病毒A/CK/GX/1875/2004（GX1875）、A/DK/ST/3208/2012（ST3208）,H6N6亚型禽流感病毒A/CK/ZZ/346/2014（ZZ346）、A/CK/ZZ/1923/2015（ZZ1923）、A/CK/JX/20490/2014（JX20490）作为实验毒株。选择前期已证实结合人型受体的人流感病毒临床分离株H3N2亚型A/ST/602/2006（ST602）作为结合SAα-2,6Gal受体和体外感染实验阳性对照毒株,结合禽型受体的禽流感病毒H9N2亚型A/DK/GX/767/2010（GX767）作为结合SAα-2,3Gal受体阳性对照毒株。禽流感病毒在10天的鸡胚培养,人流感病毒在犬肾细胞来源的传代细胞MDCK培养。血凝素（Hemagglutination,HA）试验检测病毒HA滴度,组织细胞半数感染量(50%tissue culture infective dose,TCID50)试验、空斑形成单位（Plaque forming units,PFU）试验确定后续感染实验的病毒感染量。2.病毒受体结合特性检测:使用α2,3-Sialidase酶特异性切除火鸡红细胞上的SAα-2,3Gal受体,保留下SAα-2,6Gal受体,通过酶切前后的病毒HA滴度变化筛选出具有结合人型受体能力的禽流感病毒株。3.病毒在A549细胞、BEAS-2B细胞的复制能力检测:选用具有结合人型受体能力的禽流感病毒感染A549细胞、BEAS-2B细胞,通过检测不同时间点的培养上清液HA滴度、细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）评价病毒复制能力。4.病毒在体外人呼吸道组织的复制能力检测:病毒体外接种人肺组织和人支气管组织,TCID50试验检测不同时间点组织匀浆的病毒滴度,免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）检测细胞内病毒核蛋白（Nucleoprotein,NP）抗原的表达。5.呼吸道组织NLRP3炎症小体及下游通路蛋白检测:免疫组化检测病毒感染人肺组织、人支气管组织后NLRP3炎症小体成分NLRP3、ASC以及下游通路蛋白Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的表达,酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测组织匀浆中IL-1β、IL-18含量变化。结果:1.受体结合特性检测结果:实验组毒株GX1875和ZZ346具有同时结合禽型受体SAα-2,3Gal和人型受体SAα-2,6Gal的能力,但以结合SAα-2,3Gal受体为主。而ST3208、ZZ1923、JX20490仅与禽型受体SAα-2,3Gal结合。阳性对照组中,禽流感病毒GX767与禽型受体SAα-2,3Gal结合,人流感病毒ST602与人型受体SAα-2,6Gal结合。2.病毒在A549细胞、BEAS-2B细胞的复制能力检测结果:实验组毒株GX1875、ZZ346和阳性对照毒株ST602以感染复数（Multiplicity of infection,MOI）为1、10的病毒感染量分别感染A549细胞和BEAS-2B细胞。随着接种时间的延长,3株毒株均能引起A549细胞和BEAS-2B细胞产生CPE,其HA滴度均呈上升趋势（P＞0.05）,其中GX1875在接种A549细胞24 h后的HA滴度高于ZZ346（P＜0.05）。3.病毒在体外人呼吸道组织的复制能力检测结果:在人肺组织中,阳性对照毒株ST602,实验组毒株ZZ346、GX1875分别在接种12 h、24 h和24 h、48 h后检测到TCID50滴度,其中阳性对照毒株ST602在接种24 h后达到复制高峰,其TCID50滴度高于ZZ346和GX1875（P＜0.05）,但3株毒株接种人肺组织12 h、48 h后的TCID50滴度没有统计学差异（P＞0.05）。在人支气管组织中,3株毒株接种12 h、24 h后均可检测到TCID50滴度（P＞0.05）,但随后阳性对照毒株ST602的TCID50滴度开始下降,在接种48 h后低于检测下限,而实验组毒株ZZ346、GX1875在接种24 h后达到复制高峰（P＞0.05）,但在接种48 h后同样有不同程度下降,ZZ346下降幅度更大,甚至低于检测下限,而GX1875的TCID50滴度高于ZZ346（P＜0.05）。免疫组化检测发现,实验组毒株ZZ346、GX1875接种人肺组织和人支气管组织后病毒NP抗原均呈阳性表达,主要表达在人肺组织的肺泡巨噬细胞、肺泡细胞和人支气管组织的支气管上皮细胞。4.呼吸道组织NLRP3炎症小体及下游通路蛋白检测结果:禽流感病毒GX1875、ZZ346毒株和人流感病毒ST602毒株体外感染人肺组织和人支气管组织后,可诱导人肺组织NLRP3炎症小体及下游通路蛋白激活,以诱导ASC和GSDMD表达增加为主（P＜0.05）,主要激活于肺泡巨噬细胞,其次是肺泡细胞和浸润的炎症细胞,可诱导人支气管组织ASC、GSDMD、IL-1β和IL-18不同程度的激活,以诱导ASC表达增加为主（P＜0.05）,主要激活于支气管上皮细胞。ELISA检测结果显示,3株流感病毒体外感染人肺组织和人支气管组织后均检测到IL-1β和IL-18的表达,但表达量较少,与空白对照组比较,无统计学差异（P＞0.05）。结论:1.H6N6亚型禽流感病毒ZZ346毒株、H9N2亚型禽流感病毒GX1875毒株具有结合人型受体SAα-2,6Gal的能力,并可以在体外人肺和人支气管组织以及A549细胞和BEAS-2B细胞中有效复制,提示具有结合人型受体能力的禽流感病毒具有感染人类的潜能。2.应用体外感染人呼吸道组织模型初步研究表明,具有结合人型受体能力的禽流感病毒和人流感病毒可诱导人肺组织NLRP3炎症小体及下游通路蛋白激活,以诱导ASC和GSDMD表达增加为主,主要激活肺泡巨噬细胞,也可诱导人支气管组织ASC、GSDMD、IL-1β和IL-18不同程度的激活,以诱导ASC表达增加为主。