序列决定了DNA分子特性,DNA序列的变化导致人类个体间的差异。约90%的DNA序列变化归因于单核苷酸多态性(SNP),即基因组水平上单个位点碱基的改变。SNP与人类进化、遗传性疾病、个体药物敏感性等困扰人类从而引起普遍关注的问题紧密相关,对SNP的研究将会对人类进化过程、基因定位、药物开发、疾病诊疗等方面产生深远影响。其中,建立适用于遗传性疾病、肿瘤的早期诊断以及诊疗过程的简便快速的SNP检测方法在临床诊疗中具有十分重要的意义。本论文研究目标就是采用普通的分析仪器,建立简便快速识别具有不匹配碱基的核苷酸链的方法,使之能应用于普通诊疗机构。一、染料放大DNA杂交信号的研究插入式荧光染料与DNA双链结合后产生荧光,可以放大DNA的杂交信号,但需要采用荧光光度计检测信号。花青染料在可见光区具有强吸收,如果能与DNA双链特异性结合,就可以将DNA杂交信号转化为可见光区的光吸收信号,用普通分光光度计就可进行检测。本章基于花青染料3-乙基-2-[7-(3-乙基-2-苯并噻唑啉)-1,3,5-庚三烯]碘化苯并噻唑与DNA杂交双链的特异性结合作用,将DNA的杂交信号转化为染料在可见光区的光吸收信号。实验结果表明,与DNA杂交双链结合后,该染料在760 nm处产生强吸收峰,吸光度数值及其稳定性受杂交链长度和体系温度的影响。在25℃条件下,采用24-mer探针,可以检测μg·mL-1数量级的互补DNA链,比DNA自身杂交信号灵敏度提高两个数量级。在优化条件下,利用该染料还可识别短链DNA中存在的SNP。与其它DNA片段的检测以及SNP的识别方法相比,该方法更为简便迅速,在临床诊疗中具有潜在的应用价值。二、反胶束介质调控DNA杂交反应的研究DNA杂交反应前后,在260 nm处的吸光度会有变化。杂交双链匹配度不同,吸光度的变化幅度不同。这一光吸收信号可以采用紫外分光光度计检测。但是,水溶液中进行的DNA杂交反应,浓度高至100μmol/L时,DNA分子的紫外吸光度超出仪器检测范围。浓度低至1 u mol/L,杂交前后吸光度的变化幅度小,也观测不到吸光度的变化。反胶束介质使局部浓集于水核中的DNA分子杂交,同时DNA的表观浓度大大降低,反胶束介质还降低了DNA的杂交反应速度和杂交双链的稳定性,使不同匹配度DNA双链的紫外吸光度产生差异,因此用紫外分光光度计即可检测SNP。但是文献研究表明反胶束中DNA杂交反应速率太慢,单个样品检测周期约4小时。本章采用合成的24个碱基的DNA片段,在AOT反胶束中研究了影响DNA杂交反应速度的因素。采用析相的方法,使反胶束溶液两相分离,析相后DNA仍存在于有机相(反胶束)中。析相后DNA链仍能进行杂交反应,杂交反应速度加快。根据不同匹配度DNA链杂交后紫外吸光度,可以识别存在不匹配碱基的DNA链。利用库仑滴定法测定有机相中水分含量,双链不匹配度越高,有机相中水分含量越高,根据有机相中水分含量,也可以识别具有不匹配碱基的核苷酸链。三、DNA杂交信号的酶放大研究近年来,利用酶催化反应转换和放大各种检测信号的方法越来越受到关注。2002年,Alan S.等人报道了利用生物工程修饰酶放大DNA检测信号的方法,首次将DNA的杂交反应信号转换并放大为酶催化反应信号。但是,该方法的局限性在于对酶、抑制剂和DNA的修饰连接过程太过复杂。核酸适配体是1990年被发现的一类特殊的寡核苷酸链,可以通过一种称之为SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)的离体选择过程获得。1992年通过SELEX筛选出凝血酶核酸适配体,可以抑制凝血酶对纤维蛋白原的水解活力。本章基于凝血酶与G15D核酸适配体的特异性结合原理,在G15D核酸适配体上修饰DNA分子信标结构,修饰后的探针在溶液中形成G-四聚体和分子信标两个结构域,G-四聚体结构域与凝血酶结合,抑制了凝血酶的水解活力。当溶液中存在与分子信标环部互补的DNA链时,由于DNA的杂交反应,使分子信标结构被打开,G-四聚体结构被破坏,凝血酶复活。不同匹配度DNA链与探针链杂交后,探针的G-四聚体结构被破坏的程度不同,凝血酶的活力不同,通过测定凝血酶的活力可以识别具有不匹配碱基的目标链。凝血酶的活力用凝血酶水解纤维蛋白原的初凝时间表示。由于凝血酶凝血时间是临床诊断中一种测定人体凝血功能的常规检测方法,将SNP的识别信号转化为凝血酶凝血时间,将易于在普通的诊疗机构推广应用。四、核酸适配体对凝血酶的变构作用研究凝血酶与底物复合物结晶、凝血酶定点突变、分子模拟等方法常常用来研究凝血酶变构作用。通过对凝血酶与凝血酶调制蛋白(thrombomodulin, TM)的结晶复合物检测,发现TM与凝血酶结合并没有引起凝血酶构象改变。但又有研究表明,TM结合于凝血酶使凝血酶对蛋白质C的识别能力增强。对于外结合位点Ⅰ和Ⅱ之间是否有相互作用这一重要问题,也始终没有一致的结论,有的研究认为两个位点之间有构象相关性,即外结合位点Ⅰ与配体的结合会使外结合位点Ⅱ失去与配体的结合能力,但是有些研究又认为两个位点之间没有关联。G15D核酸适配体特异性结合于凝血酶外结合位点Ⅰ,抑制凝血酶对纤维蛋白原的水解活力,抑制凝血酶与TM的结合。DNA 60-18(29)核酸适配体结合于外结合位点Ⅱ,也抑制凝血酶对纤维蛋白原的水解活力。由于G15D核酸适配体和DNA 60-18(29)核酸适配体本身并不被凝血酶水解,并且凝血酶水解发色底物的反应不受核酸适配体的抑制,因此本章用核酸适配体来研究外结合位点对凝血酶的变构作用。本章我们选用核酸适配体研究外结合位点对凝血酶的变构作用。首先,核酸适配体可以分别结合于凝血酶的两个位点,本身不被凝血酶水解。其次,相对于TM、纤维蛋白原等大分子蛋白类底物,核酸适配体对酶构象和活力检测的干扰大大减小。此外,凝血酶水解小分子发色底物的反应不被核酸适配体抑制,可以直接检测凝血酶水解活力的变化。研究结果表明,核酸适配体与凝血酶的结合会引起凝血酶构象的轻微改变,这种改变可以促进凝血酶对发色底物的水解。这一现象似乎可以说明,大分子底物结合于凝血酶外结合位点,不仅有利于底物的酶切位点与凝血酶活性中心的接触,还可以促进凝血酶的水解活力。五、基于核酸适配体与凝血酶的相互作用测定凝血酶本章基于核酸适配体和凝血酶相互作用的研究结果,利用核酸适配体制作生物传感器来检测凝血酶。用方波电势脉冲(SWPP)法制备纳米多孔金电极,将巯基修饰的G15D核酸适配体固定在纳米多孔金电极上,之后利用核酸适配体结合溶液中的凝血酶,凝血酶的另一个结合位点连接与金纳米颗粒结合的巯基-DNA60-18[29]核酸适配体,形成三明治式结构。为了减少凝血酶与金纳米颗粒上核酸适配体的交互作用,还在金纳米颗粒表面固定了不与凝血酶结合的寡核苷酸链。利用电极外层吸附的阳离子还原剂[Ru(NH3)6]3+产生电化学信号。由于纳米多孔金和金纳米颗粒的放大作用,所形成的传感器可以非常灵敏地用于凝血酶的检测。