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脓毒症是由感染引起的全身炎症反应,可引起严重的器官功能衰竭,其发病率和死亡率均很高,严重威胁人类生命健康。血管通透性增加是脓毒症重要的病理生理过程,是导致器官功能损伤的重要原因之一。关于脓毒症血管通透性的机制与防治有大量研究,并在临床取得一定的效果,但还有待进一步阐明。水通道蛋白(Aquaporin,Aqp)是一种能介导水快速进出细胞的膜转运蛋白,在大鼠体内有12种亚型,各亚型在各器官表达和功能不一。研究发现Aqp除作为通道调节水和甘油及其他小分子物质进出细胞外,还能作为细胞信号分子介导细胞的迁移、分化、分泌等功能。目前研究发现Aqps在脑缺血缺氧再灌注损伤、肿瘤、肾病、视网膜损伤及干燥综合症等多种疾病的病理生理过程发挥着重要作用。同时研究发现Aqps在与血管通透性相关疾病也发挥作用。Aqps是否参与脓毒症肺血管通透性的调节及哪种Aqp在其中起主要作用目前不清楚。据此,本课题采用大鼠盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型,研究(1)Aqp3在脓毒症肺血管通透性的作用;(2)Aqp3对脓毒症肺血管通透性的调节机制;(3)SS-31通过Aqp3对脓毒症肺血管通透性的保护作用。主要实验方法:采用盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型,提取大鼠原代肺静脉内皮细胞;提取肺静脉和内皮细胞RNA和总蛋白;使用PCR的方法检测肺静脉中Aqp3的表达变化;使用蛋白免疫印迹检测肺静脉和内皮细胞Aqp3、Cav-1、Occludin蛋白变化;异硫氰酸荧光素标记的荧光白蛋白透过来检测肺血管及内皮细胞的通透性;ROS试剂盒测肺静脉和内皮细胞ROS变化;使用小RNA对Aqp3的表达进行干扰。研究内容:第一部分Aqp3在脓毒症肺血管通透性的作用1.采用大鼠盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型,取正常和脓毒症大鼠肺静脉,提取各组肺静脉组织RNA,测各种水通道蛋白RNA的表达变化。在动物水平通过多批次实验证明,Aqp的12个亚型在脓毒症肺血管的表达大多增强,其中Aqp3的增强趋势更明显。因此猜测Aqp3在脓毒症肺血管通透性中起重要作用。2.在动物水平,采用大鼠盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型,测脓毒症6h和脓毒症12h和假手术组大鼠肺血管通透性变化,同时提取各组大鼠肺静脉,检测肺静脉中Aqp3的表达变化,初步了解脓毒症大鼠肺血管通透性的变化和Aqp3表达变化的关系。在细胞水平,提取原代肺静脉内皮细胞,使用LPS(1μg/ml)分别作用肺静脉内皮细胞6h和12h,观察LPS刺激后的内皮细胞通透性变化和Aqp3的表达变化,进一步了解LPS刺激肺静脉内皮细胞后通透性变化和内皮细胞Aqp3表达变化的关系。另外,在细胞水平,提取原代内皮细胞,采用小RNA干扰Aqp3,观察LPS引起的肺静脉内皮细胞通透性变化,明确Aqp3在脓毒症肺血管通透性中的作用。第二部分Aqp3调节脓毒症肺血管通透性的机制在动物水平上,采用大鼠盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型,提取脓毒症6h、12h组和假手术组大鼠肺静脉,测肺静脉中影响穿细胞途径蛋白Cav-1和细胞旁途径紧密连接蛋白Occludin的表达变化。在细胞水平上,提取原代肺静脉内皮细胞,使用LPS(1μg/ml)作用肺静脉内皮细胞6h和12h,测LPS作用不同时间的肺静脉内皮细胞Cav-1和Occludin的表达。同时,在细胞水平,提取原代内皮细胞,使用小RNA干扰Aqp3,测LPS作用的肺静脉内皮细胞Cav-1和Occludin的表达。第三部分SS-31通过Aqp3对脓毒症肺血管通透性的保护作用在动物水平,采用盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型,在模型结束后经尾静脉注射不同剂量的SS-31(0.5mg/kg,1mg/kg,3mg/kg),观察给药后的肺血管通透性变化;另外,复制脓毒症模型,模型结束后尾静脉注射SS-31(3mg/kg),对照组尾静脉注射生理盐水,取模型组和对照组大鼠肺静脉,测Aqp3表达和ROS的变化,验证SS-31通过调节Aqp3对脓毒症肺血管通透性的保护作用。在细胞水平,提取原代肺静脉内皮细胞,使用SS-31(0.1μg/ml)预处理细胞,观察LPS(1μg/ml)作用后测内皮细胞通透性和Aqp3的表达及ROS的变化,验证SS-31通过Aqp3对LPS刺激的肺静脉内皮细胞的保护作用。主要研究结果:第一部分Aqp3在脓毒症肺血管通透性作用1.脓毒症大鼠肺静脉中多种Aqps的RNA表达增强,包括Aqp1,3,4,7,11,12,其中Aqp3增强趋势最明显。在动物水平随着脓毒症时间的延长肺血管通透性和Aqp3的表达增强越明显,脓毒症6h和12h组较假手术组肺血管通透性和Aqp3的蛋白表达明显升高,Aqp3的表达和通透性的变化一致;在细胞水平LPS刺激6h和12h肺静脉内皮细胞通透性显著增加,Aqp3的蛋白表达也明显升高。2.在细胞水平干扰Aqp3能有效拮抗LPS刺激引起的内皮细胞通透性升高。第二部分Aqp3在脓毒症肺血管通透性机制1.脓毒症后影响跨细胞途径蛋白Cav-1表达增强,细胞旁途径紧密连接蛋白Occludin的表达减弱。LPS刺激后肺静脉内皮细胞Cav-1表达增强,Occludin的表达减弱,与动物水平上变化一致。2.细胞水平上干扰Aqp3后能拮抗LPS刺激肺静脉内皮细胞Cav-1增强和Occludin的减弱。第三部分SS-31通过Aqp3对脓毒症肺血管通透性的保护作用1.脓毒症后大鼠肺静脉ROS表达增加,SS-31预处理能拮抗脓毒症ROS的增加;同时SS-31预处理脓毒症大鼠能拮抗脓毒症肺血管通透性的增加和Aqp3表达增强。2.LPS刺激后肺静脉内皮细胞ROS表达增加,SS-31预处理拮抗LPS刺激引起的内皮细胞ROS的升高;同时SS-31预处理LPS刺激的肺静脉内皮细胞能拮抗内皮细胞通透性和Aqp3表达的增强,与动物水平一致。3.SS-31预处理后能改善脓毒症大鼠存活率和存活时间。结论:1.Aqp3对脓毒症肺血管通透性起调节作用;2.Aqp3参与脓毒症肺血管通透性的调节可能通过穿细胞和跨细胞途径;3.SS-31对脓毒症肺血管通透性具有保护作用,其作用可能是通过抗氧化来实现。