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Mx(Myxovirus resistance)是一种由Ⅰ型干扰素(IFNα/β)诱导的具有GTP酶活性的抗病毒蛋白，具有广谱抗病毒活性。对Mx蛋白多种多样抗病毒活性机制研究非常重要。作为Mx蛋白家族的一员，猪Mx1蛋白已经被证实对流感病毒和水疱性口炎病毒有强大的抗病毒能力，但目前国内外尚未报道对猪瘟病毒的抗病毒研究。猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的严重危害养猪业的传染性疾病，被国际兽医局(OIE)列为必须通报的传染病之一。
本文对猪Mx1蛋白进行了原核表达和真核表达，制备鼠抗多克隆抗体，在细胞上研究猪Mx1蛋白的抗病毒活性。
1.猪源Mx1基因的原核表达、鉴定及抗血清制备
本研究通过设计一对特异性引物，从pT-poMx1中扩增出Mx1基因开放式阅读框(1992bp)，并将其编码区插入到携带GST标签的原核表达载体PGEX-6p-1中，经酶切和序列测定后，构建了重组质粒PGEX-poMx1;将其转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白并分析表达效果。结果表明:经终浓度为0.8mmol/L IPTG诱导后4h，poMx1基因在BL21(DE3)中获得高效表达，表达量占菌体蛋白的32.6％，SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为99KDa。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠，制备了特异性多抗血清，Western blot结果显示该抗血清与融合蛋白孵育反应后有明显的特异性条带，该研究为poMx1蛋白抗病毒的效果鉴定和机制研究奠定了基础。
2.猪源Mx1蛋白的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究
通过设计一对特异性引物扩增出poMx1全长基因并与蛋白转导域(PTD)基因串联。将PTD-poMx1克隆至原核表达载体pCold-Ⅰ。鉴定正确的阳性克隆转化大肠杆菌Rosetta2并在0.1mmol/LIPTG诱导下进行表达。SDS-PAGE结果显示，融合蛋白主要以包涵体形式表达，相对分子质量为74.2KDa。融合蛋白经过纯化、变性、透析复性和浓缩后进行入胞试验，Western blot结果表明80μg/ml PTD-poMx1与Vero细胞孵育6h后能明显检测到融合蛋白成功转导进入细胞。
Vero细胞感染100TCID50VSV后进行噬斑减少试验，160μg/mL、80μg/mL和20μg/mL PTD-poMx1蛋白处理组VSV滴度Log(PFU/mL)分别为8.05、8.10和8.31，而没有用融合蛋白处理的对照组VSV滴度Log(PFU/mL)是8.55。表明在PTD-poMx1蛋白的存在下，VSV在Vero上的增殖受到了抑制，抑制作用随着处理蛋白的浓度增加而增强，而160μg/mL组和80μg/mL组相比抑制作用增强幅度不大，所以选择80μg/mL作为融合蛋白抑制病毒复制试验的处理浓度。VSV接种Vero细胞检测其TCID50,发现80μg/mL组VSV TCID50下降了101.1。SYBR GreenⅠ real-time PCR检测VSV在Vero细胞上增殖的mRNA水平，VSV感染24h、48和72h后，对照Vero细胞中增殖的病毒分别是融合蛋白处理组增殖病毒的43.1倍、9.4倍和4.1倍。一系列结果均表明转导进入Vero细胞的PTD-poMx1融合蛋白发挥了抗病毒效果。
PK-15细胞感染猪瘟病毒石门株，用间接免疫荧光法测定病毒TCID50，发现用80μg/mL PTD-poMx1蛋白处理后病毒滴度从104.2/mL下降到了103.6/mL。200TCID50感染PK-15细胞24h、48h和72h后，对照组猪瘟病毒的mRNA水平分别是融合蛋白处理组的2.5倍、1.9倍和2.1倍。结果说明PTD-poMx1蛋白的存在对猪瘟病毒的复制产生了抑制作用。
3.稳定表达猪源Mx1蛋白PK-15细胞系的建立及其抗猪瘟病毒的初步研究
根据GenBank所收录的poMx1基因序列设计一对特异性引物，从pT-poMx1亚克隆出目的基因片段，双酶切纯化后克隆至真核表达载体pEGFP-C1，构建重组质粒pEGFP-poMx1，经PCR扩增、酶切和测序分析该重组质粒;脂质体转染猪肾细胞(PK-15)后，经G418抗性筛选，通过RT-PCR、Western blot和荧光观察，鉴定表达的融合蛋白;结果表明:建立了能稳定表达poMx1蛋白的PK-15细胞系(PK-15/EGFP-poMx1)，RT-PCR能够检测到转录产生的EGFP-poMx1 mRNA、Westernblot鉴定到99KDa的融合蛋白，直接荧光观察到融合蛋白主要在胞浆中呈现颗粒性表达。将猪瘟病毒石门株接种建立的细胞系PK-15/EGFP-poMx1后，TCID50测定、间接免疫荧光和SYBR GreenⅠ real-time PCR检测结果表明:与对照组PK-15相比，细胞系感染猪瘟病毒24h、48h和72h后的收获的上清病毒液滴度都有所下降，随着时间的增加下降幅度有所减小;细胞系中病毒荧光斑明显减少，病毒mRNA水平明显降低。说明在PK-15细胞系中稳定表达的融合蛋白EGFP-poMx1能够抑制猪瘟病毒的复制，降低子代病毒含量。通过激光共聚焦显微镜的观察研究猪瘟病毒E2蛋白和EGFP-poMx1融合蛋白的亚细胞定位，发现两个蛋白共定位在细胞核周围。该研究结果为猪源Mx1蛋白抗猪瘟病毒的机制研究奠定了基础。