论文部分内容阅读
羊传染性脓疱病毒（Orf virus，ORFV）是痘病毒科副痘病毒属的代表种，具有嗜上皮性，绵羊、山羊以及人发生感染后通常在口、唇等部位皮肤出现丘疹、脓疱等损伤性病变，因此该病又俗称为“羊口疮”（Orf）。Orf作为一种人兽共患传染病，对人类的健康构成了严重威胁。目前，该病的发生、流行均呈上升趋势。宿主感染谱也在逐渐扩大，除感染中小反刍动物外，也不断有野生动物发生感染的报道。近年来，研究者对ORFV的基因组结构、免疫特性以及载体应用等方面进行了大量的研究；然而，目前仍没有有效预防和治疗羊传染性脓疱病的方法和措施。病毒的感染和致病是一个非常复杂的过程，病毒侵染宿主后能够引起易感细胞的一些调控基因差异表达及其所介导信号通路改变，造成细胞生理功能异常从而导致疾病的发生。因此，本项目从病毒与宿主相互作用的角度入手，利用Illumina/Solexa测序技术构建羊源原代胚胎鼻甲（ovine fetal turbinate，OFTu）细胞感染ORFV后48h和96h的mRNA表达谱，进行差异表达基因的筛选。在感染病毒后48h，筛选得到了1047个表达上调基因，366个表达下调基因；在感染病毒后96h，有1570个基因表达上调，982个基因表达下调；GO分析结果表明，差异基因参与的分子功能主要有催化活性、结合活性、酶调节活性、分子转导活性和蛋白结合转录因子活性等；参与的生物学过程主要有免疫过程、生物调节过程、代谢过程和应激反应等。Pathway分析结果显示，所筛选得到的差异表达基因主要参与炎症、免疫、细胞自噬以及细胞凋亡等相关通路。该部分研究结果将为针对ORFV与宿主互作研究的开展提供重要的理论依据，并为进一步揭示ORFV致病的分子机制奠定基础。近年来，许多研究已经证实自噬和病毒感染之间具有直接的作用关系。然而，ORFV是否能够诱导细胞自噬却并未见有报道。我们前期研究对ORFV感染前后差异表达基因进行了筛选鉴定，生物信息学分析发现了与细胞自噬相关的差异表达基因如自噬标志性分子LC3表达上调。细胞自噬是机体一种非常重要的保护和防御机制，能够将受损细胞器、胞质内容物进行循环再利用，为细胞提供合成底物和能量来维持细胞稳态。因此，我们选择在生理和病理以及先天性免疫和获得性免疫过程中发挥重要作用的自噬作为研究方向。本研究在ORFV感染OFTu细胞或Hela细胞后，利用透射电镜、间接免疫荧光和免疫印迹分别进行了自噬体形态学观察、内源性LC3的定位以及LC3的型别转换的检测；结果发现，ORFV能够诱导OFTu细胞和Hela细胞自噬体的形成。因为自噬是一个动态过程不仅包括自噬体的形成，而且还包括自噬体与溶酶体融合运送被降解物到自噬溶酶体降解的过程。因此我们又进一步通过免疫印迹对自噬底物SQSTMl/p62进行了检测；结果显示，ORFV感染宿主细胞（OFTu细胞和Hela细胞）后能够诱导自噬体和溶酶体融合进而降解自噬底物。在证实ORFV能够诱导宿主细胞发生完整的自噬过程后，本研究用自噬诱导剂（Rapa或EBSS）以及自噬不同时期（早期抑制剂3-MA和晚期抑制剂CQ）的抑制剂处理宿主细胞后，接种ORFV，利用免疫印迹对LC3的型别转换进行了检测。在有效诱导或抑制自噬后，检测ORFV的感染滴度。结果发现，诱导自噬或抑制自噬后，ORFV的感染滴度并未发生明显变化。这可能是宿主在ORFV入侵时激活了自噬过程进行自我保护，而ORFV可能也会编码一些蛋白来逃避或抵御宿主抗病毒反应。为了进一步明确ORFV感染诱导宿主细胞自噬的机制。本研究在ORFV感染细胞或Rapamycin处理细胞后，提取细胞总蛋白，进行了免疫印迹分析；结果显示，ORFV感染组以及Rapamycin处理组的mTOR的磷酸化水平降低，而LC3-Ⅱ的表达量显著升高，说明mTOR信号途径在ORFV诱导细胞自噬过程中具有重要的作用。为了进一步验证mTOR途径的抑制是ORFV诱导自噬的关键步骤，我们对Rheb基因进行定点突变后构建了能够激活mTOR活性的Rheb激活形式：pCMV-myc-Rheb Q64L过表达载体。将pCMV-myc-Rheb Q64L转染细胞后，进行免疫印迹分析；结果显示，转染Rheb Q64L后mTOR的磷酸化水平明显升高，而LC3-Ⅱ表达量下降；说明Rheb Q64L恢复了mTOR的活性。在证实ORFV能够通过抑制mTOR途径诱导细胞自噬后，我们对mTOR上游的Erk1/2和TSC2的表达变化进行了检测，发现ORFV能够激活TSC2和Erk1/2的活性。用U0126（Erk1/2抑制剂）处理Hela细胞后，接种病毒，免疫印迹分析mTOR、Erk1/2以及TSC2的磷酸化水平；结果显示，p-Erk1/2和LC3-Ⅱ的表达量明显被抑制，而mTOR的磷酸化水平显著升高，同时，p-TSC2也被抑制。之后，我们将设计合成的3对靶向TSC2的siRNA（siTSC2-1，siTSC2-2和siTSC2-3）转染细胞，发现siTSC2-1，siTSC2-2和siTSC2-3的抑制效率分别为73.4%、65.4%和93.1%。将siTSC2-3转染细胞后，接种病毒，免疫印迹分析p-mTOR、p-TSC2以及p-Erk1/2的表达变化；结果发现，TSC2的磷酸化水平和LC3-Ⅱ的表达量降低，p-mTOR发生上调，而p-Erk1/2未出现明显变化。以上结果说明ORFV感染宿主后能够通过激活Erk1/2，使TSC2活化，进而抑制了mTOR的活性，最终诱导自噬的发生。以上研究结果将为进一步研究ORFV的感染特性和分子致病机制奠定了基础。