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长爪沙鼠作为一种待开发的―多功能‖实验动物,具有广泛应用前景。国内外学者利用长爪沙鼠特殊的生物特性建立了多种人类疾病动物模型。为了研究诸多疾病的发生、发展、治疗和转归机制需要各种实验动物模型,但目前长爪沙鼠尚未建立转基因及基因敲除/敲减等动物模型。本实验利用一种新型的应用广泛的方便快捷的方法—CRISPR/Cas9技术在长爪沙鼠上进行转基因方法探索,为长爪沙鼠动物模型研究和相关基因功能奠定技术基础。原核生物中CRISPR-Cas编码的是一种适应性免疫系统用来抵御感染的病毒和质粒。免疫是由Cas核酸,通过小型RNA介导(crRNAs)其酶切入侵的核酸的基因组内特定酶切解位点。在II型CRISPR-Cas系统中,DNA切割活性通过由RNA引导单一酶Cas9进行。使用合成单个引导RNA(gRNA),Cas9可以重新编程中的各种生物的基因组以创建特定双链DNA断裂,几乎在所以实验动物中,都可以构成用于遗传工程的有力工具。动物克隆和转基因等胚胎生物技术需要超数排卵提供足够数量的卵与胚胎,因此超数排卵对动物胚胎生物技术研究具有重要意义。为了得到长爪沙鼠最佳的超数排卵方案,我们通过对长爪沙鼠使用时周龄、激素剂量及间隔时间的优化,确定一种高效稳定的超数排卵方案。经排卵数统计发现,超数排卵优化方案为:6周龄雌性长爪沙鼠,腹腔注射PMSG/hCG的剂量为各10IU,激素注射间隔时间为70小时,注射激素后立即与雄鼠合笼,在16~17小时后取卵。通过该方案,与对照组相比,排卵数为32.6±3.0枚/只,其中24.8±5.4枚/只经培养后可以发育至二细胞胚胎,效率远高于对照组(p<0.05)。据此我们获得了利用PMSG和hCG诱导长爪沙鼠超数排卵的优化方案,为长爪沙鼠之后的胚胎生物技术奠定基础。我们基于靶基因序列通过网络资源软件,筛选打靶位点,以5’-N20NGG-3’形式存在的23bp序列,并得到每个位点的评分,初步筛选高活性gRNA。进一步检测体外gRNA诱导活性检测,体外酶切活性较好的(酶切活性>70%)为筛选最佳的gRNA。将选定的gRNA构建到CRISPR-Cas质粒载体上,导入DH5α大肠杆菌中,筛选阳性菌,提取质粒DNA并测序验证。测序正确的质粒经酶切后分别体外转录成Cas9 mRNA和gRNA。调整Cas9 mRNA和gRNA以最佳浓度比,Cas9mRNA浓度:100-200ng/μL,gRNA浓度:10-50 ng/μL,50~80%的受精卵在原核显微注射后仍保持健康。显微注射后健康的受精卵一部分培养至8-细胞以上,提取基因组DNA,并对其进行敲除检测;另一部分显微注射后健康的受精卵,通过胚胎移植技术将其移植到假孕受体母鼠输卵管内,待出生仔鼠后,对新生仔鼠提取基因组DNA,进行敲除检测。实验所探索和优化条件为长爪沙鼠CRISPR-Cas系统基因敲除方法建立奠定基础。