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慢性牙周炎(Chronic periodontitis,CP)是牙周细菌感染,导致牙周附着组织和牙槽骨破坏,而引起的慢性非特异性感染性疾病。目前临床上对牙周炎严重程度的评价指标主要有:牙周探诊深度(probing depth,PD)、銀沟出血指数(sulcus bleeding index,SBI)和X线等,然而这些指标均只能代表单一病变的最终结果,并不能及时准确地反映牙周炎的发生、发展变化。在牙周炎的发生、发展过程中,除细菌微生物感染外,宿主的免疫调节作用也尤为重要,尤其是细胞因子参与的免疫调节作用。细胞因子是由活化的免疫细胞或其它细胞分泌的有生物学活性的蛋白质,通过与靶细胞受体结合后,激活细胞信号通路,从而调节细胞生理功能,介导炎症反应,参与免疫应答和组织修复等。因此,细胞因子在促进牙龈组织炎症,加速牙周结缔组织的破坏和牙槽骨的吸收中具有重要作用。所以,寻找有效的、重要的牙周炎发生发展相关细胞因子是阐述牙周炎发病机理,研究早期诊断和治疗靶点亟需解决的重要课题。本项目拟在结合前人及前期工作的基础上,以牙周炎患者为研究对象,探讨白细胞介素-12(Interleukin-12,IL-12)家族中白细胞介素-35(Interleukin-35,IL-35)和白细胞介素-23(Interleukin-23,IL-23)在牙周炎发生发展中的作用及其相关机制,为进一步了解牙周炎的发病机制,寻找有效的牙周炎诊断靶点及临床开发新型牙周炎诊疗技术奠定基础。[实验目的]研究慢性牙周炎患者牙龈组织中IL-23、IL-35亚基及受体表达情况。研究慢性牙周炎患者龈沟液和血清中IL-23、IL-35和可溶性CD14(soluble cluster differentiation 14,sCD14)表达情况及与临床指标的相关性。探讨IL-35、IL-23在牙周炎发生发展中的作用及其相关机制。[内容与方法]本课题的研究内容分为以下两个部分第一部分慢性牙周炎患者牙龈组织中IL-23和IL-35亚基表达检测及意义分析1、实时荧光定量 PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)检测慢性牙周炎患者牙龈组织中IL-23(p19、p40),IL-35亚基p35、EBI3基因表达;2、蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测慢性牙周炎患者牙龈组织中IL-23(p19、p40),IL-35 亚基 p35、EBI3 蛋白表达;3、IL-23和IL-35亚基表达与各项临床指标的关系。第二部分慢性牙周炎患者龈沟液和血清中IL-23、IL-35和sCD14表达检测及意义分析1、记录治疗前后各项临床指标的变化;2、治疗前后龈沟液及外周血中IL-23、IL-35和sCD14含量检测;3、IL-35、IL-23和sCD14含量与CP患者疾病程度的关系分析;4、CP患者龈沟液与外周血IL-35、IL-23和sCD14关系分析;5、CP患者IL-35、IL-23和sCD14相关性分析;[结果]1、CP患者牙龈组织中的p19mRNA、p40mRNA、p35mRNA和EBI3mRNA相对表达量均显著高于健康志愿者(healthy volunteers,HV);2、CP患者牙龈组织p19、p40、p35和EBI3蛋白与Real-timePCR检测一致均显著高于HV志愿者;3、重度CP患者牙龈组织p40 mRNA和EBI3 mRNA相对表达量均显著高于中度CP患者;4、CP患者牙龈组织中p35 mRNA相对表达量与EBI3 mRNA相对表达量呈显著正相关;5、重度CP患者牙龈组织中p19 mRNA相对表达量与p40 mRNA相对表达量呈正相关性;6、CP患者龈沟液及外周血中的IL-35,IL-23和sCD14高表达;7、IL-35、IL-23和sCD14含量与CP患者疾病程度有关;8、治疗前CP患者GCF中的IL-35,IL-23和sCD14与其血液中的正相关;9、CP患者龈沟液中IL-35和sCD14含量之间存在显著的相关性;[结论]本研究中,我们采用RT-PCR和Western blot检测发现CP患者牙龈组织确实存在p19、p40、p35和EBI3异常表达,尤其是CP患者牙龈组织p19、p40、p35和EBI3在蛋白和mRNA水平均显著高于健康牙龈组织,提示p19、p40、p35和EBI3介导了 CP患者的慢性炎症过程,且与疾病的严重程度相关。p40是IL-12家族促炎细胞因子IL-12和IL-23的重要组成亚基,而EBI3是IL-12家族抑炎细胞因子IL-27和IL-35的重要组成亚基。在重度CP患者牙龈组织p40mRNA和EBI3mRNA相对表达量均显著高于中度CP患者,差异均有统计学意义,提示重度CP患者牙龈组织促炎信号和抑炎信号均活跃。30例CP患者牙龈组织中p19 mRNA、p40 mRNA、p35 mRNA 和 EBI3 mRNA 仅 p35 mRNA 相对表达量与 EBI3 mRNA相对表达量呈明显正相关性。p35和EBI3是IL-35组成亚基,这提示IL-35的确介导了 CP的发生发展,尤其在重度CP患者中,IL-35可能是CP患者牙龈组织中的重要抑炎信号。p19是IL-23独有亚基,CP患者牙龈组织p19高表达,且相关性显示p19与组成IL-23的另一亚基p40存在一定相关性,而在重度CP患者中,p19 mRNA和p40 mRNA相对表达量呈显著正相关,提示IL-23可能也介导了 CP患者牙龈组织中的局部炎症过程。另外,在CP患者龈沟液和外周血中存在高浓度的IL-35,IL-23和sCD14,并且发现龈沟液中IL-35,IL-23和sCD14含量升高且与外周血IL-35,IL-23和sCD14含量相关。更重要的是,我们发现CP患者IL-35含量升高与sCD14有关,而与IL-23含量无关。IL-35可能促进sCD14诱导先天免疫细胞介导的炎症反应参与CP发病。