硫化氢预处理间充质干细胞来源的细胞外囊泡在缺氧缺血性脑损伤中的机制研究

来源 :山东大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:penghong97
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研究背景:新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)主要是由重度围生期窒息导致的疾病,发病率高、死亡率高,常导致新生儿死亡和幸存者常患有长期神经系统发育障碍。临床上针对新生儿HIE尚无完善统一的治疗策略,目前的治疗以综合支持治疗为主,但其治疗效果并不十分显著,因此寻求安全有效的治疗策略尤为重要。在缺氧缺血(Hypoxic-ischemia,HI)后,脑血流量的改变引发神经细胞能量代谢障碍,释放大量兴奋性氨基酸、自由基、一氧化氮等物质以及凋亡细胞释放的促炎介质激活小胶质细胞导致中枢神经系统(Central nervous system,CNS)免疫微环境发生改变。由于HI后血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)的破坏以及CNS中免疫微环境的改变诱导外周免疫细胞向CNS浸润。激活的小胶质细胞/单核-巨噬细胞具有不同的功能表型,M1型小胶质细胞/单核-巨噬细胞释放大量的促炎因子,导致神经炎症和组织损伤;M2型小胶质细胞/单核-巨噬细胞分泌抑炎因子和神经营养因子,参与抑炎过程促进组织修复。因此,在HI后抑制小胶质细胞激活,促进小胶质细胞/单核-巨噬细胞向抑炎的M2型极化对于抑制神经炎症,减轻脑损伤有重要意义。细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是一种由脂质双分子层包绕形成的球状膜性囊泡,作为继细胞接触依赖和细胞因子信号转导途径之外的第三种信号转导途径,可通过其所携带的含量丰富的miRNA对靶细胞的基因进行负向调控。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)来源的EVs具有多种生物学作用,可通过免疫调节、抗凋亡、抗氧化、促增殖等作用参与多种疾病的病理生理学进程。硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)是一种内源性信号分子,参与大脑一系列病理生理进程的调节,在CNS中具有神经保护作用。研究目的本研究旨在探讨H2S预处理MSCs后分泌的EVs(H2S-EVs)与普通EVs相比是否具有更优越的神经保护作用及其可能机制。实验方法1.模型建立:本研究使用出生后7天的C57BL/6J新生小鼠建立HI模型,参考Rice-Vannucci法进行造模。实验组小鼠麻醉固定后剪开颈部皮肤,游离右侧颈总动脉并结扎,送回母鼠身侧恢复30 min,然后在8%02+92%N2、37℃条件下连续缺氧2 h。假手术(Sham)组则只游离右侧颈总动脉不结扎也不进行缺氧。2.实验分组及药物干预:(1)实验设计一:本实验的目的是为了探讨新生小鼠HI后72 h EVs和H2S-EVs对HI新生小鼠急性期脑损伤的影响。将新生小鼠随机分为以下4组:Sham组、HI 组、HI+EVs 组和 HI+H2S-EVs 组。将 100 μg EVs 或 H2S-EVs(1.5 × 108 个囊泡)溶于50 μL PBS中,HI+EVs组和HI+H2S-EVs组在HI后24 h经左心室注射EVs和H2S-EVs,Sham组和HI组则注射等量的PBS。在HI后72 h取各组脑组织进行后续实验。(2)实验设计二:在新生小鼠HI后5周使用行为学测试评价EVs和H2S-EVs的长期疗效。分组同实验设计一。行为学测试包括新物体识别测试和水迷宫测试。(3)实验设计三:本实验的目的是为了探讨H2S-EVs具有更优越的神经保护作用是通过其携带的miR-7b-5p实现的。首先用miR-7b-5p抑制剂(inhibitor)及其阴性对照(inhibitor negative control,INC)转染MSCs,随后再加入硫氢化钠孵育 MSCs,收集其分泌的 EVs 即 H2S-EVs-miR-7b-5pinhibitor和H2S-EVs-miR-7b-5pINC。将小鼠随机分为以下 4 组:HI 组、HI+H2S-EVs 组、HI+H2S-EVs-miR-7bINC 组、HI+H2S-EVs-miR-7binhibitor组。根据不同分组,小鼠分别 从左 心 室注 射 PBS、H2S-EVs、H2S-EVs-miR-7b-5pinhibitor 和H2S-EVs-miR-7b-5pINC。所有EVs(100μg/50μL)均在新生小鼠HI后24 h左心室注射给药,在HI后72 h取脑组织进行后续实验。(4)实验设计四:本实验的目的是为了探讨miR-7b-5p/FOS轴是否参与H2S-EVs在HI新生小鼠中的神经保护。在新生小鼠HI前72 h使用慢病毒LV-shFOS及其阴性对照LV-shNC处理小鼠。随后将动物分为4组:HI组、HI+H2S-EVs组、HI+LV-shNC 组、HI+LV-shFOS 组。HI+H2S-EVs 组在 HI 后 24 h 左心室注射 100μg/50 μL H2S-EVs,其余各组则注射等量的PBS。在HI后72 h取各组脑组织进行后续实验。(5)实验设计五:本实验的目的是评估miR-7b-5p是否对HI新生小鼠具有神经保护作用。在新生小鼠HI前2 h使用miR-7b-5p agomir及其阴性对照NC处理小鼠。随后将动物分为4组:HI组、HI+H2S-EVs组、HI+miR-7bNC组、HI+miR-7bagomir组。在HI后72 h取脑组织进行后续实验。3.检测方式:(1)透射电镜、qNano、Western blot对EVs进行鉴定。(2)免疫荧光观察H2S-EVs在新生小鼠HI后72 h脑组织以及脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激后的原代小胶质细胞/BV-2细胞的分布。(3)Western blot、逆转录及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Reverse transcriptase quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)、免疫组织化学技术、脑含水量检测、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验、TTC染色等方法检测不同实验设计中炎症因子表达水平,小胶质细胞激活程度,脑水肿、脑梗死情况、小胶质细胞/单核-巨噬细胞极化表型及miR-7b-5p的表达。(4)行为学测试:在新生小鼠HI后5周,使用使用新物体识别实验(novel object recognition test,NORT)和水迷宫(Morris water maze,MWM)检测不同分组小鼠长期神经功能情况。4.统计分析:在实验中使用SPSS软件进行数据分析,所有数值都使用平均值士标准差(mean±SD)表示。在MWM训练期使用重复测量双因素方差分析来评估小鼠的每日表现分数;在MWM测试期不同分组的每日得分使用单因素方差分析并用Bonferroni校正。其他数据均使用单因素方差进行分析并用Bonferroni或Dunnet’s tests进行校正。p<0.05即认为有差异统计学意义。实验结果:1.EVs的鉴定外泌体标志物CD9、TSG101在两种EVs中均有表达。qNano显示两种EVs的直径主要在60-150 nm之间,符合EVs的特点。透射电镜显示两种EVs呈现圆形或类圆形膜结构。2.H2S-EVs的分布本实验室曾发现,EVs处理HI新生小鼠后48h大量聚集于右侧(损伤侧)半球小胶质细胞/单核-巨噬细胞,同时少量聚集于神经元和星形胶质细胞。所以在本试验中侧重于观察H2S-EVs在HI新生小鼠中的靶向性,免疫荧光结果显示H2S-EVs同普通EVs结果一致,大量聚集于损伤侧半球的Iba-1+小胶质细胞内。同时在右侧半球损伤区NeuN+神经元以及GFAP+星形胶质细胞中也发现了一定数量的H2S-EVs。使用LPS(500 ng/mL)和PKH67染料标记的H2S-EVs共孵育原代小胶质细胞和BV-2细胞,发现H2S-EVs在原代小胶质细胞和BV-2细胞中均有聚集。3.H2S-EVs改善新生小鼠HI后72 h脑损伤新生小鼠 HI 后 72 h,EVs(p<0.01)与 H2S-EVs(p<0.001)处理明显降低了 HI诱导的脑水肿。新生小鼠HI后72 h,EVs(p<0.001)和H28-EVs(p<0.001)处理明显减轻了 HI诱导的脑梗死程度,H2S-EVs减轻脑梗死程度的效果优于 EVs(p<0.05)。4.H2S-EVs抑制新生小鼠HI后72 h的细胞凋亡新生小鼠HI后72 h进行TUNEL染色检测细胞凋亡。与HI组相比EVs与H2S-EVs处理均降低了 HI诱导的细胞凋亡数量(p<0.001 HI VS EVs;p<0.001 HI VS H2S-EVs);且与EVs相比,H2S-EVs的改善作用更为明显(p<0.05)。新生小鼠HI后72 h,检测损伤侧皮层组织凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、caspase-3的表达水平,与HI相比,EVs和H2S-EVs可以明显降低cleaved caspase-3/caspase-3的比值(p<0.01 HI VS EVs;p<0.001 HI VS H2S-EVs);同时且与EVs相比,H2S-EVs降低凋亡水平的作用更为明显(p<0.05)。5.H2S-EVs对新生小鼠HI后72 h损伤侧皮层的免疫调控作用新生小鼠HI后72 h进行Iba-1免疫组化染色,EVs(p<0.001)与H2S-EVs(p<0.001)均可以抑制HI诱导的小胶质细胞的激活,且与EVs相比,使用H2S-EVs后Iba-1+细胞数量明显减少(p<0.01)。新生小鼠HI后72 h使用qRT-PCR检测损伤侧皮层组织炎症因子mRNA水平,与HI组相比,H2S-EVs明显抑制促炎因子mRNA的水平,包括以下促炎因子:白细胞分化抗原11b(Cluster of differentiation 11b,CD 11b)(p<0.001),CD32(p<0.001),CD86(p<0.001),环氧化酶2(Cyclooxygenase 2,COX2)(p<0.001),诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)(p<0.001),白细胞介素 1β(Interleukin 1β,IL-1β)(p<0.001),IL-6(p<0.001)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor,TNFα)(p<0.001);与EVs组相比,H2S-EVs对以下促炎因子mRNA表达的抑制作用也优于 EVs 组:CD 11b(p<0.01),CD32(p<0.001),CD86(p<0.001),IL-1β(p<0.05)。此外,与 HI 组与 EVs 组相比,H2S-EVs 明显上调 CD206 mRNA的表达(p<0.01:H2S-EVs VS HI;p<0.001:H2S-EVs VS HI+EVs)。FCM结果显示,在新生小鼠HI后72 h,与HI组相比,EVs和H2S-EVs处理显著降低了 CD11b+/CD45high浸润免疫细胞的增加(p<0.001 HI VS EVs;p<0.001 HI VS H2S-EVs)。此外与HI组相比,EVs和H2S-EVs处理显著促进了浸润单核-巨噬细胞(p<0.001 HI VS EVs;p<0.001 HI VS H2S-EVs)和原驻小胶质细胞(p<0.001,p<0.001)向M2型极化,且与EVs组相比,H2S-EVs促进了浸润单核-巨噬细胞(p<0.05)和原驻小胶质细胞(p<0.05)向M2型极化的作用更为显著。6.H2S-EVs促进新生小鼠HI后远期神经功能恢复在新生小鼠HI后5周NORT和MWM实验评估小鼠的远期学习和记忆能力。NORT结果显示,与Sham组相比,HI组小鼠识别新物体的能力显著降低(p<0.05),而使用H2S-EVs处理后则明显改善了小鼠的新物体识别能力(p<0.05)。MWM结果显示,在训练期(1-5天)各组小鼠的平均逃逸潜伏期均逐渐变短,提示各组小鼠均具有一定的学习能力。与Sham组相比,在第5天HI组小鼠逃逸潜伏期较长(p<0.01),同时与HI组相比,使用H2S-EVs治疗后其第5天逃逸潜伏期明显变短(P<0.05)。在第6天测试期,与Sham组相比,HI组小鼠穿越平台所在位置的次数(p<0.01)、在平台象限停留时间(p<0.01)均减少,而其逃逸潜伏期延长(p<0.01)。与HI组相比,使用H2S-EVs处理后其穿越平台所在位置次数明显增加(p<0.05),逃逸潜伏期变短(p<0.01),而在平台所在象限停留的时间没有变化。7.H2S-EVs上调HI新生小鼠脑内的miR-7b-5p,减轻脑损伤及神经炎症发挥神经保护作用对EVs和H2S-EVs的miRNA进行高通量测序,与EVs相比,H2S-EVs中有 19 个 miRNAs 上调,7 个 miRNAs 下调(差异倍数≥2,p<0.05),qRT-PCR验证结果显示H2S-EVs中miR-7b-5p的表达水平高于EVs(p<0.01)。接下来首先使用miR-7b-5p inhibitor及其阴性对照预处理MSCs,随后加入NaHS孵育MSCs 获得的 EVs 即 H2S-EVs-miR-7b-5pinhibitor和 H2S-EVs-miR-7b-5pINC,检测miR-7b-5p inhibitor是否能抑制H2S-EVs中miR-7b-5p的表达水平,结果显示与H2S-EVs-miR-7b-5pINC相比 H2S-EVs-miR-7b-5pinhibitor中 miR-7b-5p 的表达水平明显降低(p<0.001)。新生小鼠HI后2h,12 h,24 h,72 h损伤侧皮层中miR-7b-5p的表达水平均降低(p<0.001,p<0.001,p<0.001)。与 HI 组相比,EVs 与 H2S-EVs 治疗后均可提高HI后72 h新生小鼠损伤侧皮层miR-7b-5p的表达(p<0.001 HI VS EVs;p<0.001 HI VS H2S-EVs),同时与EVs组相比,使用H2S-EVs治疗提高HI后72h损伤侧皮层miR-7b-5p表达水平的效果更为显著(p<0.001)。随后使用EVs组脑组织切片进行FISH实验,miR-7b-5p在新生小鼠HI后72 h于损伤侧Iba-1+小胶质细胞中表达。新生小鼠HI后72 h,H2S-EVs处理明显降低了 HI诱导的脑水肿(p<0.05)、脑梗死(p<0.001)程度;同时本实验发现与H2S-EVs-miR-7b-5pINC组相比,H2S-EVs-miR-7b-5pinhibitor组在HI后72h 脑水肿(p<0.01),脑梗死程度增加(p<0.001)。qRT-PCR 检测炎症因子 mRNA 表达水平,与 H2S-EVs-miR-7b-5pINC相比,H2S-EVs-miR-7b-5pinhibitor显著促进了促炎因子 CD16(p<0.001)、CD86(p<0.001)、IL-1β(p<0.01)和 TNFα(p<0.001)mRNA 的表达;抑制了抑炎因子CD206(p<0.001)的表达。接下来在新生小鼠HI后72 h,进行Iba-1免疫组化染色,与 H2S-EVs-miR-7b-5pINC 组相比,H2S-EVs-miR-7b-5pinhibitor 组显著促进了小胶质细胞的激活(p<0.001)。此外本研究发现,在HI前2 h侧脑室注射miR-7b-5p agomir可显著降低HI诱导的脑水肿(p<0.05)和脑梗死程度(p<0.001)。8.H2S-EVs通过调控miR-7b-5p/FOS轴抑制HI诱导的脑损伤及神经炎症,发挥神经保护作用使用双荧光素酶报告基因实验验证miR-7b-5p可以抑制FOS的表达,与miR-7b-5p NC组相比,miR-7b-5p mimics转染入细胞后所测得荧光素酶活性明显降低(p<0.001);而当FOS 3’-UTR被突变后,两组之间所测得荧光素酶活性没有变化。在新生小鼠HI后72 h,与HI组相比,H2S-EVs处理后损伤侧皮层FOS mRNA水平(p<0.001)与c-FOS蛋白水平(p<0.01)的表达均下调,而miR-7b-5p inhibitor 的使用则逆转了 H2S-EVs 对 FOS mRNA(p<0.001)水平与 c-FOS 蛋白水平(p<0.05)表达的下调作用。在HI前72 h使用FOS干扰慢病毒(LV-shFOS)及其阴性对照(LV-shNC)侧脑室注射,LV-shFOS处理可干扰脑内FOS mRNA(p<0.001)与c-FOS蛋白(p<0.001)的表达。与使用LV-shNC相比,LV-shFOS干扰脑内FOS的表达后,降低了 HI后72 h的脑水肿、脑梗死(p<0.01,p<0.001)程度。同时,LV-shFOS干扰脑内FOS的表达后,抑制HI后72 h新生小鼠损伤侧皮层促炎因子mRNA的表达:CD16(p<0.001)、CD86(p<0.001)、IL-1β(p<0.001)和 TNFα(p<0.001);促进抑炎因子 CD206 mRNA(p<0.001)的表达。此外,LV-shFOS干扰脑内FOS的表达后,明显抑制新生小鼠HI后72 h小胶质细胞的激活(p<0.01)。结论及意义本研究表明:在HI后H2S-EVs比普通EVs具有更优越的神经保护作用,同时也阐明了其可能机制。H2S预处理MSCs后明显上调EVs中miR-7b-5p的表达,H2S-EVs作为高丰度miR-7b-5p的天然递送载体将miR-7b-5p递送至HI新生小鼠损伤侧小胶质细胞/单核-巨噬细胞,抑制小胶质细胞/单核-巨噬细胞活化,同时促进已活化的小胶质细胞/单核-巨噬细胞向M2型极化,减轻神经炎症,改善HI新生小鼠远期学习和记忆功能。此外,本研究发现H2S-EVs对HI新生小鼠具有更优越的神经保护作用,因此对EVs进行改造也可成为围生期脑损伤的潜在治疗策略。
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