研究背景:近年来,冠心病的发病呈逐年上升且低龄化的倾向,已成为我国重大的公共卫生问题。经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous Coronary Intervention,PCI)是目前冠心病血运恢复的重要临床手段。中国接受PCI治疗人数的逐年增加,年平均增长率在10%-15%,但PCI术后再狭窄严重限制了血运重建的远期效果,即便随着新一代DES广泛应用,再狭窄率仍高达12%,因此关于再狭窄的研究一直是近年的热点。PCI术后再狭窄的本质是血管内膜损伤部位组织的过度愈合反应,导致平滑肌细胞增殖、迁移和细胞基质沉积使新生内膜过度增生所致,内皮损伤是引起血管再狭窄的始动因素及主要环节,加速局部内皮化,促进内皮快速修复可降低再狭窄,而内皮修复延迟,则可导致再狭窄的发生。内皮是如何修复的呢?传统的观点认为血管内皮损伤后主要通过循环内皮细胞迁移、增殖来修复损伤血管,至20世纪末,研究发现内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)才真正是损伤的血管再内皮化的重要细胞来源。EPCs由骨髓干细胞衍生,在生理或病理因素刺激下,可由骨髓动员到外周血,归巢于损伤部位,并增殖分化为内皮细胞,促进损伤血管内皮的修复。PCI致血管损伤后EPCs可快速动员然后定植于损伤部位,加速再内皮化,从而有效减少平滑肌细胞增殖,抑制内膜的过度增生。已有研究证实PCI术后再狭窄患者外周血中无论EPCs数量、还是其增殖能力、迁移能力均显著降低。所以,PCI术后再狭窄形成的进程中,EPCs数目减低或/和功能下降或是支架术后再狭窄的关键因素所在。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)最主要的生物学活性分子,其在促进细胞分化、增殖、生长及调节血管张力、血容量方面均有重要作用。多项研究显示AngⅡ可以促进EPCs凋亡,减少其数量,引起EPCs功能下降,而阻断AngⅡ后可以明显减少EPCs凋亡数量,改善其功能,其机制主要是促进活性氧的生成,诱发机体的氧化应激、降低端粒酶活性,加速EPCs衰老和凋亡,而此作用可被缬沙坦阻断。近年国内外一些研究在恶性高血压、先兆子痫、肾移植等患者血清中均发现了抗AT1R的自身抗体(Angiotensin II type 1 Receptor Autoantibodies,AT1-AA)的存在,其可通过专一识别结合AT1受体的细胞外第二环功能表位肽段(the second extracellular loop of the angiotensin II type 1 receptor,AT1R-ECⅡ),激活AT1受体,产生与AngⅡ激活AT1R相类似的生物学效应。目前,AT1-AA在PCI术后支架再狭窄方面的研究还处于初期阶段,AT1-AA是否会导致支架再狭窄,是否通过影响EPCs而发挥作用,通过何种机制尚不清楚。本文将对以上几个方面问题进行研究。第一部分:AT1受体自身抗体滴度与冠脉支架植入术后再狭窄的关系分析目的:在恶性高血压、先兆子痫、肾移植患者血清中可检测到抗血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体(AT1-AA)的存在,该自身抗体可激活AT1受体,与AngⅡ激活AT1R产生相类似的生物学效应。我们将探讨冠脉支架植入术后再狭窄与AT1-AA的关系。方法:根据PCI术后患者冠脉造影复查结果是否发生支架再狭窄分为再狭窄组和非再狭窄组(分别为50例和60例),同时设置冠心病组(已行冠脉造影但未植入支架,60例),对照组(行冠脉造影排外冠心病者,40例),均除外急性心肌梗死,且四组患者性别、年龄、冠心病危险因素(包括高血压、高血脂、糖尿病、吸烟等)、药物服用情况及支架植入情况(再狭窄组和非再狭窄组比较)等基线特征差异无统计学意义,均卧位采静脉血10ml,采用酶联免疫吸附法(ELISA)对标本血清进行AT1-AA检测,相同方法检测AngⅡ,比较各组间AT1-AA的OD值及阳性率,以及AngⅡ浓度的差别。另选择门诊年轻健康的体检者15例留静脉血做AT1-AA检测的阴性对照。结果:再狭窄组AT1-AA阳性率(62.0%,31例阳性/50例),明显高于非再狭窄组(35.0%,21例阳性/60例)、冠心病组(16.7%,10例阳性/60例)、对照组(7.5%,3例阳性/40例),差异均有统计学意义(P<0.05),再狭窄组OD值与非再狭窄组、冠心病组、对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),非再狭窄组的虽低于再狭窄组,但是与冠心病组及对照组比较,阳性率和OD值偏高,差异有统计学意义(P<0.05),冠心病组与对照组比较,冠心病组的阳性率及OD值略高,差异有统计学意义(P<0.05)。再狭窄组与非再狭窄组比较AngⅡ差异无统计学意义(P>0.05);再狭窄组、非再狭窄组与冠心病组比较,再狭窄组与非再狭窄组略高,但差异无统计学意义(P>0.05);再狭窄组、非再狭窄组与对照组比较,再狭窄组与非再狭窄组较高,差异有统计学意义(P<0.05);冠心病组与对照组比较,冠心病组略高,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.支架再狭窄组与非再狭窄相比AT1-AA较高,提示AT1-AA可能对PCI术后再狭窄有影响。2.与未植入冠脉支架组相比,植入支架两组的AT1-AA较高,提示PCI过程可能导致AT1-AA升高。第二部分:AT1受体自身抗体与动物血管损伤后修复状况的研究目的:首先主动免疫大鼠产生AT1-AA,然后行球囊损伤大鼠颈总动脉,并观察AT1-AA对损伤血管修复的影响。方法:1.分组:55只大鼠分为4组,A组为AT1-AA组+球囊损伤组,15只,B组为AT1-AA+缬沙坦组+球囊损伤组,15只,C组为单纯球囊损伤组,20只,D组为正常对照组,5只。2.主动免疫:AT1多肽与载体偶联得到完全抗原,与弗氏完全佐剂混匀乳化后以0.4ug/kg的AT1多肽量于大鼠背部多点皮下注射,对A组、B组进行主动免疫,C组及D组采用等量弗氏完全佐剂大鼠背部多点皮下注射,后每2周对A组、B组进行进行一次强化免疫,采用AT1多肽偶联物与弗氏不完全佐剂乳化。3.对B组即AT1-AA+缬沙坦+球囊损伤组自首次免疫开始以2mg/kg/d缬沙坦灌胃至处死。4.大鼠血清AT1-AA的检测:A组、B组大鼠在主动免疫开始前、之后2周、4周、6周、8周、10周时眼眶采血,应用ELISA法检测大鼠体内的AT1-AA滴度。5.于主动免疫6周时建立大鼠左颈总动脉球囊损伤的模型:麻醉大鼠,手术切开分离颈部皮肤和组织,暴露其左颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,自颈外动脉送入经修剪的PTCA导丝及1.5*8mm PTCA球囊至左颈总动脉,加压球囊,并来回抽动,损伤血管内膜。以上为A组、B组和C组的操作,D组为正常对照组。6.标本取材,处理:D组为正常对照组,5只大鼠于麻醉后解剖分离血管,取出左颈总动脉,大鼠追加麻药致死,左颈总动脉用0.9%氯化钠溶液冲洗管腔,分为3段,分别进行HE染色、电镜检查、荧光定量PCR(RT-PCR)测定一氧化氮合酶(e NOS)m RNA,以做基础参照。C组中5只大鼠拟观察损伤后即刻情况,于球囊损伤后立即取出受损的左颈总动脉,大鼠追加麻药致死,取出左颈总动脉为球囊损伤即刻标本,冲洗后处理同上。A组、B组各15只和C组中剩余15只大鼠,于造模后7天、2周、4周分3批处死大鼠,每组每次5只,取出左颈总动脉(同时取出右侧颈总动脉做对照),冲洗后处理同上。。6.1 HE染色观察染色结果,测定平均内膜面积(IA)、中膜面积(MA)、管腔面积(LA),计算IA/MA,管腔狭窄率[1-(左颈总动脉管腔面积/右颈总动脉管腔面积)]。6.2扫描电镜检查将标本沿纵向剖开,经戊二醛和锇酸双重固定、梯度乙醇脱水、醋酸正(异)戊酯置换后,于临界点干燥,经离子溅射喷金后用S-3500N型扫描电子显微镜扫描观察,测定内皮细胞覆盖情况。6.3应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)测定一氧化氮合酶(e NOS)m RNA将组织研磨后经RNA提取、反转录c DNA、荧光定量PCR,由PCR反应曲线所得的Ct值,采用△△Ct方法进行相对定量。结果:(1)大鼠ATI-AA的滴度A组、B组大鼠主动免疫前静脉血中未检出AT1-AA,主动免疫2周时,在静脉血中可检出AT1-AA,滴度为1:(250±82.3),4周、6周、8周的滴度逐渐升高,10周滴度为1:(7000±2340.5),6周、8周、10周的AT1-AA滴度与2周时相比有显著差异(P<0.01),提示主动免疫成功。(2)HE染色结果球囊损伤即刻,观察到内皮细胞完全剥脱。至损伤1周时,AT1-AA+球囊损伤组、AT1-AA+缬沙坦+球囊损伤组、单纯球囊损伤组均观察到新生血管内膜形成,管腔则轻度变窄,但三组内膜面积(IA),中膜面积(MA),IA/MA,LA(管腔面积)无统计学意义(P>0.05),2周时,镜下三组内膜增厚较前明显,其中可见较多增生迁移至此的平滑肌细胞,管腔变小,三组中AT1-AA+球囊损伤组IA,IA/MA最高,LA最小,AT1-AA+缬沙坦+球囊损伤组次之,单纯球囊损伤组最轻,比较有统计学差异(P<0.05),中膜差别不大。损伤4周时,各组差异更加明显,AT1-AA+球囊损伤组IA达到了0.914±0.024 mm2,IA/MA 4.562±0.032,LA为0.048±0.023mm2,而单纯球囊损伤组内膜增生最轻,IA为0.336±0.027 mm2,IA/MA 1.504±0.030,LA 0.138±0.026 mm2,两组比较有显著性差异(P<0.01),AT1-AA+球囊损伤组与AT1-AA+缬沙坦+球囊损伤组有统计学差异(P<0.05),三组MA比较无统计学意义(P>0.05)。各时间点每只大鼠取材时所取右侧颈总动脉标本行HE染色,测算平均管腔面积,计算狭窄率[1-(左颈总动脉管腔面积/右颈总动脉管腔面积)]。损伤1周、2周时,AT1-AA+球囊损伤组、AT1-AA+缬沙坦+球囊损伤组、单纯球囊损伤组狭窄率比较无统计学意义,4周时三组的狭窄率分别为70.4%,61.8%,52.3%,比较均有统计学意义(P<0.05),其与上IA,IA/MA,LA指标三组比较的结果类似。综上,AT1-AA+球囊损伤组、AT1-AA+缬沙坦+球囊损伤组、单纯球囊损伤组三组球囊损伤后新生内膜会逐渐增生修复,三组2周时差异显现,4周时差异显著,AT1-AA+球囊损伤组新生内膜增生最为明显,管腔面积最小,狭窄率最高,加入缬沙坦组上述状况改善明显,单纯球囊损伤组新生内膜增生最轻,管腔面积最大,狭窄率最低。提示AT1-AA可使受损血管新生内膜明显增厚,管腔变小,狭窄程度增高,而缬沙坦可部分改善此状况。(3)电镜结果在每个组织标本中随机取5个视野(1.0k)计数内皮细胞后取平均值。在1.0k和3.0k的视野中可观察到球囊处理前后内皮细胞的数量发生明显变化,经球囊处理后内皮细胞基本消失,证实球囊损伤的比较彻底。在1.0k视野下,可观察到三组内皮细胞的修复过程,随着时间推移,各组视野内的内皮细胞逐渐增多,内皮细胞计数发现,损伤1周、2周时,三组比较差异无统计学意义(P>0.05);到4周时,单纯球囊损伤组计数最多,为(46±3.9)个,AT1-AA+缬沙坦+球囊损伤组计数为(36±5.6),AT1-AA+球囊损伤组计数为(30±2.7)个,单纯球囊损伤组与AT1-AA+球囊损伤组和AT1-AA+缬沙坦+球囊损伤组比较有统计学差异(P<0.05),AT1-AA+缬沙坦+球囊损伤组与AT1-AA+球囊损伤组相比亦有统计学差异(P<0.05),提示单纯球囊组内皮修复最快,AT1-AA+球囊损伤组修复最慢,加入缬沙坦,内皮修复改善,可能与缬沙坦拮抗AT1受体,从而抑制了AT1-AA的效应有关。行右侧颈总动脉内皮细胞计数作为参照,计算1周、2周、4周时的内皮细胞覆盖率(左颈总动脉内皮细胞数/右颈总动脉内皮细胞数),1周、2周时三组比较差异仍无统计学意义(P>0.05),4周时,AT-AA+球囊损伤组为64.2%,AT-AA+缬沙坦+球囊损伤组为72.3%,单纯球囊组为92.7%,三组两两比较有统计学差异(P<0.05)。内皮细胞覆盖率与内皮细胞计数所得出的结论是一致的。(4)荧光定量PCR检测e NOSm RNA结果在球囊损伤即刻,损伤组e NOSm RNA的2-△CT值与正常对照组(未行球囊损伤血管)比较明显减低,球囊损伤后1周时,A组(AT1-AA组+球囊损伤组),B组(AT1-AA+缬沙坦组+球囊损伤组),C组(单纯球囊损伤组)三组2-△CT值仍处于较低水平,随着时间推移,各组e NOSm RNA逐渐回升,C组升高较快,A组恢复较慢,4周时,三组差异明显,其中C组最高,A组最低,B组居中,C组与A组,B组比较均有显著差异,B组与A组比较也有统计学意义,A,B,C三组球囊损伤4周时e NOSm RNA与正常对照相比的相对表达量(2-△△CT),C组最高,为0.547,仍未达到正常水平,A组最低,B组居中,提示AT1-AA对e NOSm RNA表达水平的有影响,可使其恢复延缓,而在AT1-AA基础上给予缬沙坦阻断AT1-AA作用可使这种延缓状况得到改善。结论:1.AT1-AA作用于受损血管可使新生内膜明显增厚,管腔变小,从而导致再狭窄,而缬沙坦可明显改善此状况;2.基于各组扫描电镜内皮细胞计数和计算内皮细胞覆盖率的差异及e NOS恢复的差异,提示AT1-AA可导致内皮修复延迟;3.再次证实内皮修复延迟可使新生内膜增厚明显,与再狭窄发生密切相关。第三部分:体外实验AT1-AA对EPCs的影响目的:已知EPCs参与受损内皮的修复过程,EPCs损害会导致内皮修复延迟,最终导致再狭窄。研究提示AngⅡ可以促进EPCs的衰老和凋亡增加,导致其功能下降,AT1-AA与AngⅡ作用类似,但AT1-AA对EPCs影响的研究目前较少,本部分拟行体外实验,观察AT1-AA对EPCs的影响及机制。方法:1.MTT法检测EPCs生存活力:应用2.5、5和10μM的AT1-AA处理细胞EPCs24 h,或10μM的AT1-AA处理EPCs3、6、9、12和24 h,MTT法检测细胞生存活力检测,再加入缬沙坦检测。2.DAPI染色检测EPCs凋亡情况(2.5、5和10μM)AT1-AA和1μM缬沙坦单独或复合处理细胞,DAPI常温染色,激光共聚焦电子显微镜观察细胞核情况。通过观察20个不同视野计算凋亡小体数获得细胞凋亡率。3.流式细胞检测测定EPCs凋亡情况Annexin-V/PI双染法检测EPCs凋亡情况。(2.5、5和10μM)AT1-AA和1μM缬沙坦单独或复合处理EPCs,用缓冲液(含5μL Annexin V-FITC和2.5μL PI)重新悬浮细胞,细胞流式仪测定EPCs凋亡情况。4.活性氧(ROS)水平检测CM-H2DCFDA细胞渗透剂检测细胞ROS情况。缬沙坦(1μM)预处理EPCs后再与AT1-AA(10μM)孵育,后细胞用DCF-DA(20μM)孵育,使用激发波长488 nm、发射波长530 nm荧光光谱仪检测细胞ROS水平。5.细胞内钙离子浓度检测Fluo-4 AM染色检测EPCs内钙离子浓度。EPCs中加入缬沙坦(1μM)及AT1-AA(10μM)孵育12 h后再加入Fluo-4 AM 25°C孵育30 min,使用激发波长488 nm、发射波长522 nm荧光光谱仪检测细胞内钙离子浓度。6.钙蛋白酶活性检测EPCs细胞接种到24孔培养板中,用钙螯合剂(BAPT)或钙蛋白酶抑制剂(calpeptin)处理EPCs1 h,用加入钙蛋白酶底物(40M)的培养基培养,使用激发波长360 nm、发射波长460 nm荧光光谱仪检测细胞内钙蛋白酶活性。7.蛋白免疫印迹Western blot检测细胞p-ERK,p-e IF-2α,CHOP,Bcl-2和Caspase-3蛋白表达。步骤:1做样,2 SDS-PAGE凝胶电泳,3蛋白转膜,4接抗体,5显影。结果:1.1 AT1-AA可诱导的EPCs生存活力的降低。首先研究AT1-AA对EPCs生存活力的影响。EPCs用2.5、5和10μM的AT1-AA处理24h,或10μM的AT1-AA处理3、6、9、12和24h。结果显示AT1-AA能抑制EPCs细胞的生存活力,并存在剂量与时间上的依赖。同时,AT1-AA有效处理条件(10μM处理12h)被选择作为进一步研究的条件。然后缬沙坦(0.5、1和2μM)预处理细胞24h或1μM预处理细胞2、4、6、8、12和24h,同样获得缬沙坦的有效处理条件(1μM处理4h)。结果表明,AT1-AA处理EPCs细胞,明显降低了EPCs细胞的生存活力,而且,缬沙坦预处理细胞后,明显拮抗了AT1-AA诱导的EPCs细胞生存活力的降低。以上结果表明,AT1-AA可诱导EPCs生存活力的降低,该效应可被缬沙坦抑制。1.2 AT1-AA可诱导的EPCs凋亡及缬沙坦的保护效应。为探究AT1-AA诱导的EPCs生存活力的降低是否与细胞凋亡相关及缬沙坦对其的影响,以(2.5、5和10μM)AT1-AA和(1μM)缬沙坦单独或复合处理内皮祖细胞,DAPI染色和细胞流式检测细胞凋亡情况。结果显示,AT1-AA处理细胞后,EPCs细胞染色质皱缩,出现凋亡小体,而且凋亡小体比例与AT1-AA存在明显的剂量依赖。缬沙坦预处理细胞后,相比AT1-AA单独处理细胞,EPCs细胞凋亡比例明显得到逆转。进一步用细胞流式(Annexin V-FITC/PI双染)检测EPCs细胞凋亡情况,结果显示,单独AT1-AA(10μM,12h)处理细胞,EPCs细胞凋亡比例达到30.3%,缬沙坦预处理细胞后凋亡比例明显得到逆转,降至13.7%。以上结果表明,AT1-AA可诱导EPCs凋亡致其生存活力降低,而缬沙坦可抑制此效应。1.3 AT1-AA诱导EPCs内ROS生成,增加细胞内Ca2+浓度,促进凋亡,缬沙坦可抑制此作用。研究表明ROS和Ca2+参与细胞凋亡转导信号通路,而且在此信号通路中相互关系密切。为了验证缬沙坦抑制AT1-AA诱导内皮祖细胞凋亡是通过降低EPCs内ROS水平及Ca2+浓度,以缬沙坦(1μM)预处理EPCs 4h,然后AT1-AA(10μM)处理细胞12h,或者AT1-AA(10μM)单独处理细胞6、12和24h。结果表明,AT1-AA上调了内皮祖细胞内ROS水平,早在90分钟的时候,细胞内钙离子浓度就有了明显提高,而且AT1-AA对内皮祖细胞的影响存在浓度依赖。与此同时,缬沙坦预处理内皮祖细胞后,相对AT1-AA单独处理细胞,EPCs内ROS水平及钙离子浓度均得到了明显的逆转。AT1-AA处理EPCs后,我们又对细胞钙蛋白酶活性进行了测定,结果钙蛋白酶活性明显增强。缬沙坦预处理细胞后,AT1-AA诱导的细胞内钙蛋白酶活性的增强也同样得到了逆转。以上结果表明,AT1-AA通过升高EPCs内ROS的表达及钙离子浓度诱导EPCs凋亡,缬沙坦预处理可降低AT1-AA对EPCs的影响。1.4 AT1-AA诱导EPCs凋亡通过ROS依赖的内质网应激途径,缬沙坦可抑制此效应。文献报道由药物诱导的ROS水平和细胞内钙离子浓度上调及内质网的激活共同引起了细胞的凋亡。本部分我们通过检测内质网应激相关蛋白(p-ERK、p-e IF-2α、CHOP、Bcl-2和Caspase-3)的表达来研究AT1-AA诱导的EPCs凋亡是否通过抑制ROS依赖的内质网应激途径。以AT1-AA(10μM)单独处理EPCs 0.5、1、3、6、9和12h,或者缬沙坦(1μM)预处理EPCs 4h后AT1-AA(10μM)处理12h,结果表明,AT1-AA单独处理EPCs,AT1-AA时间依赖性激活了p-ERK1/2,而且处理6h时,p-ERK1/2的表达就有了明显的升高,p-ERK、p-e IF-2α、CHOP和Caspase-3蛋白水平的表达也明显升高,Bcl-2的表达明显降低。缬沙坦预处理细胞后,与AT1-AA单独处理细胞相比,AT1-AA诱导的p-ERK、p-e IF-2α、CHOP和Caspase-3的升高及Bcl-2的降低均得到了逆转。以上结果表明,AT1-AA诱导的EPCs凋亡是通过ROS依赖的内质网应激途径,缬沙坦可抑制此效应。结论:1.AT1-AA可诱导ERK的激活从而调节p-e IF2α,CHOP,Bcl-2和Caspase-3,升高EPCs内ROS的表达及Ca2+浓度,即通过促进内质网应激依赖的凋亡途径诱导EPCs凋亡。2.缬沙坦可通过抑制内质网应激依赖的凋亡途径拮抗AT1-AA诱导的EPCs凋亡。