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目的:土木香（Inula helenium L.）系菊科旋覆花属植物,为多年生草本植物,广泛分布于欧洲、北美洲及东亚等地区。其根供药用,具有健胃、利尿、祛痰和驱虫等功效。目前已从土木香中分离得到土木香内酯、异土木香内酯（Isoalantolactone）和二氢土木香内酯等多种成分,这些成分具有抗肿瘤、抗炎、驱虫、抗菌、降血糖和镇痛等多种生物活性。本实验以人子宫内膜癌细胞株（HEC-1）为材料,研究异土木香内酯对HEC-1细胞增殖的抑制作用,并进一步探讨异土木香内酯抑制HEC-1细胞增殖的作用机制。方法:1 MTT（四甲基偶氮唑蓝）比色法1.1肿瘤细胞株悬液制备用RPMI-1640完全培养基调整HEC-1肿瘤细胞株浓度为2×105个/ml的细胞悬液备用。1.2体外抑瘤实验取对数生长期的HEC-1细胞,将细胞悬浮接种于96孔板,每孔50μL（含1×104个细胞）,分别加入溶剂对照（终浓度0.1% DMSO）、阳性对照顺铂和终浓度为100μmol/L、10μmol/L和1μmol/L的异土木香内酯各50μL,每组均设3个复孔,置于饱和湿度、37℃和5% CO2培养箱中培养48h。于培养结束前4h,各培养孔加入5mg/mL的MTT 10μL。培养4h后,弃去培养上清,每孔加入反应停止液150μL,振荡10min,使结晶充分溶解,用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值（OD值）,并计算细胞生存率率,细胞生存率（%）=（对照组OD值/对照组OD值）×100%。实验数据用The SPSS system V13.0软件进行处理,受试药物对细胞的浓度-效应曲线用Hill数学模型拟合,计算药物的IC50值。2荧光素酶报告基因检测取对数生长期的HEC-1细胞,以每孔5×104个细胞接种于24孔板中,用含10%FBS的RPMI-1640培养液培养细胞24 h,去培养液,用PBS洗细胞两次。每孔加入无血清的RPMI-1640培养液0.3mL。取500ng荧光素酶报告基因质粒pG13-Luc、pGBax-Luc、IgK-Luc和NFAT-Luc以及5ng内参照基因质粒SV-40-Rluc与1.2μg脂质体共同加入0.6mL无血清的RPMI-1640培养液中,混匀室温孵育30 min后转入培养孔中,每孔25μL,于饱和湿度、37℃和5% CO2培养箱中培养3 h。弃去转染液,更换10%FBS的RPMI-1640培养液0.9 mL,于饱和湿度、37℃和5% CO2培养箱中培养24 h。分别加入含有异土木香内酯（终浓度为5μmol/L和10μmol/L）和不含异土木香内酯的10%FBS的RPMI-1640培养液0.1mL,于饱和湿度、37℃和5% CO2培养箱中培养24 h。弃去培养液,用1×PLB（passive lysis buffer）裂解细胞后,立即上机检测,记录报告基因pG13-Luc、pGBax-Luc、IgK-Luc和NFAT-Luc荧光素酶与内参照基因SV-40-Rluc荧光素酶活性的比值。3 Western blotting检测取对数生长期的HEC-1细胞,按2×106个细胞/培养皿接种HEC-1细胞。加入含终浓度为2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L异土木香内酯的培养基培养细胞48小时,离心收集细胞,用PBS洗涤细胞后,加入上样缓冲液100μL,剧烈震荡后冰浴下超声波处理1min。100℃加热10min使蛋白质变性,12000r/min离心10min,取上清液测定蛋白浓度。取50μg蛋白在SDS-PAGE电泳下分离,电转移至硝酸纤维膜,用5%脱脂奶粉于室温下摇动封闭膜2 h。弃封闭液,用1×TBS-T洗膜,15min×3次。膜在抗p53多克隆抗体（1:500）和抗Bax多克隆抗体（1:700）稀释液中室温过夜孵育,1×TBS-T洗膜15 min,共3次后,在二抗稀释液（抗鼠1:5000）中孵育40 min。再次洗膜后加入ECL试剂,反应1 min,用X片曝光110 min后,显影。4半胱天冬酶抑制剂对异土木香内酯抑制HEC-1细胞增殖的翻转作用取对数生长期的HEC-1细胞,将细胞悬浮接种于96孔板,每孔50μL（含1×104个细胞）,分别加入含有半胱天冬酶抑制剂（终浓度为20μmol/L）的异土木香内酯（终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L）共同孵育HEC-1细胞和不含半胱天冬酶抑制剂的异土木香内酯（终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L）单独孵育HEC-1细胞,各50μL,每组均设3复孔,置于饱和湿度、37℃和5% CO2培养箱中培养48 h。于培养结束前4 h,各培养孔加入5 mg/mL的MTT 10μL。培养4h后,弃去培养上清,每孔加入反应停止液150μL,振荡10min,使结晶充分溶解,用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值（OD值）,并计算细胞生存率率,细胞生存率（%）=（对照组OD值/对照组OD值）×100%。结果:1 MTT（四甲基偶氮唑蓝）比色法结果本实验采用MTT法探讨了异土木香内酯对HEC-1细胞增殖活性的影响。顺铂和异土木香内酯对HEC-1细胞的增殖显示强的抑制活性,1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的顺铂和异土木香内酯处理的HEC-1细胞,其细胞生存率分别为79.16%、51.23%、24.54%和63.96%、34.67%、13.96%,并呈现较好的剂量依赖关系,与空白对照组相比具有非常显著性（P<0.01）和显著性（P<0.05）的差异,IC50分别为11.32μmol/L和4.16μmol/L。2异土木香内酯对HEC-1细胞内pG13-Luc、pGBax-Luc、IgK-Luc和NFAT-Luc的诱导表达使用10μmol/L的异土木香内酯处理HEC-1细胞后,观察其对HEC-1细胞报告基因表达的影响,结果显示,异土木香内酯可明显诱导HEC-1细胞内pGBax-Luc的表达,对p53的报告基因PG13-Luc、与NF-kB的报告基因IgK-Luc以及与NFAT的报告基因NFAT-Luc则不显示诱导活性（图2 A和B）。3异土木香内酯对HEC-1细胞内P53和Bax蛋白的上调作用为了进一步探讨异土木香内酯对HEC-1细胞内P53和Bax蛋白的影响,使用异土木香内酯处理HEC-1细胞48小时后,通过Western blotting方法检测细胞内P53和Bax蛋白的变化。结果异土木香内酯作用HEC-1细胞48小时后,细胞内的P53和Bax蛋白表达显著上调（图2C）。4半胱天冬酶抑制剂对异土木香内酯抑制HEC-1细胞增殖的翻转作用使用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的异土木香内酯处理HEC-1细胞,其细胞生存率分别为63.96%、34.67%和13.96%,使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂与土木香内酯共同孵育HEC-1细胞后,其细胞生存率分别上升为81.91%、56.05%和52.15%。结论:异土木香内酯能显著抑制HEC-1细胞的增殖活性,而且其作用机制很有可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。但是诱导细胞凋亡是一个由多信号诱导、多基因调控、多因子参与的过程,异土木香内酯诱导肿瘤细胞凋亡的具体的机制还不是非常清楚,需要进一步研究。