老年性痴呆(Alzheimer’s disease, AD)是发生在老年期或老年前期的一种中枢神经系统的慢性渐进性退行性疾病。随着社会人口的老龄化,AD的发病率和致残率、死亡率正逐年升高。AD在临床上以认知障碍、记忆损害和人格改变为主要特征,神经病理改变以脑细胞内神经纤维缠结(NFT)和细胞外老年斑(SP)以及大量神经元丢失为主要特征。作为SP的主要组成成分,Aβ是由其前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)经β-和γ-分泌酶共同剪切形成的。在病理条件下,Aβ形成高聚集态的淀粉样蛋白纤丝,从而对神经细胞产生毒性作用,引起神经细胞的死亡,进而形成SP。在AD中,Aβ主要以Aβ1-40和Aβ1-42两种形式存在,在Aβ聚集中Aβ1-42从时程和量程上均表现比Aβ1-40更强的毒性。因此,Aβ作为一个重要的分子靶点,已经成为抗老年痴呆药物研究与开发的热点。随着对AD研究的深入,研究者发现线粒体是Aβ损伤神经细胞,乃至诱导AD发生发展的最重要的亚细胞器官,同时也是Aβ最早发生寡聚化的主要场所之一。在老年痴呆的发生发展的早期即出现线粒体功能障碍即是证明之一。由于线粒体在Aβ神经毒性的产生过程中既充当了Aβ攻击靶点,又担任了Aβ发挥神经毒性的中介,因此,抑制Aβ诱导的线粒体的功能损伤成为当前抗老年痴呆的重要策略。971是中国海洋大学研制的一个酸性寡糖类药物,作为抗老年痴呆一类新药,目前正在II期临床研究中。前期研究结果显示,971以Aβ为作用靶点,通过与Aβ的特异结合,抑制纤丝形成,促进纤丝解聚,从而拮抗Aβ神经毒性,进而发挥抗老年痴呆作用。为了深入研究971的作用机理,我们利用亲和层析技术,垂钓了971的结合蛋白,并利用质谱技术进行了鉴定,结果发现971的结合蛋白中有一大部分属于线粒体蛋白,提示971可能具有靶向线粒体抗AD的作用。因此,本文中我们采用体外Flag-C99、C99-Flag以及APP/PS1转基因细胞模型,借助免疫印迹、免疫共沉淀、细胞免疫荧光染色、酶联免疫以及分子生物学等方法,探讨了971对线粒体功能的保护作用及其作用机理:1. 971保护线粒体功能试验利用APP/PS1转基因细胞模型,采用免疫荧光方法,确定971能够进入线粒体的基础上,进一步利用体外APP/PS1转基因细胞模型,将971在0,25,50,100μg/ml浓度下与细胞共孵育24小时后,分离线粒体,采用Western Blot技术,观察了,检测了线粒体内Aβ寡聚体的含量。结果发现,971进入线粒体后,可明显减少APP/PS1转基因细胞线粒体内Aβ寡聚体的含量,进一步验证了我们前期的试验结果;同时,我们通过检测线粒体COX和细胞总体ATP水平的变化,观察了上述971诱导的线粒体内Aβ寡聚体减少对线粒体功能的保护作用。结果发现,971处理后能够明显升高线粒体功能活性指标COX的水平,同时升高细胞总体ATP水平。上述结果表明971对线粒体功能具有明显的保护作用。2. 971抑制Aβ生成试验(1)971通过影响Aβ前体蛋白APP的成熟过程,抑制Aβ生成,进一步降低线粒体内Aβ寡聚化,发挥线粒体功能保护作用通过基因工程细胞株构建方法,构建了Flag-C99转基因细胞模型。利用该模型细胞,我们评价971对细胞内Aβ清除的影响。将971在100μg/ml浓度下与模型细胞共孵育24小时,借助免疫印迹(WB),免疫共沉淀(co-IP)和酶联免疫(ELISA)等检测方法,我们观察了细胞内Aβ含量的变化。结果显示,971在所检测浓度下,对细胞水平的Aβ清除过程无明显影响。在确定971不影响Aβ清除过程的基础上,我们接下来评价了971对Aβ生成的影响。利用APP/PS1双转CHO细胞模型,借助免疫印迹(WB),免疫共沉淀(co-IP)和酶联免疫(ELISA)等检测方法,我们检测了细胞内Aβ的含量。结果发现, 971在0,25,50,100μg/ml浓度下与细胞共孵育24小时后,细胞内未成熟形式的APP含量升高,成熟形式的APP含量减少,同时Aβ单体及寡聚体含量均减少。上述结果说明,971在细胞水平可影响Aβ前体蛋白APP的成熟过程,从而抑制Aβ的生成。这个结论同抗老年痴呆药物971靶向保护线粒体的功能作用及机制研究样在APP转基因CHO-K1细胞模型、APP转基因N2a细胞模型得到验证。上述结果提示,971可能通过影响Aβ前体蛋白APP的成熟过程,抑制Aβ生成,减少线粒体内Aβ含量,进一步降低线粒体内Aβ寡聚化,从而发挥保护线粒体功能的作用。(2)971通过靶向APP跨膜区,改变C99构象,专一性抑制Aβ1-42的生成,下调Aβ42/Aβ40,从而减少线粒体内Aβ寡聚化,发挥线粒体功能保护作用通过基因工程细胞株构建方法制备C99-Flag转基因细胞模型。利用该细胞模型,借助免疫印迹(WB),免疫共沉淀(co-IP)和酶联免疫(ELISA)等检测方法,我们观察了971在100μg/ml浓度下与细胞共孵育24小时后,细胞内不同Aβ片段含量的变化,评价971对细胞内不同Aβ片段生成的影响。结果发现, 971与细胞孵育一定时间后,细胞内Aβ42含量明显下降,Aβ40含量无明显变化,从而使Aβ42/Aβ40比例降低。上述结果说明971可以通过减少高毒性片段Aβ42生成,降低Aβ42/Aβ40比例,进一步发挥线粒体功能保护的作用。为进一步揭示971降低Aβ42生成的机制,我们运用分子对接计算机模拟技术,模拟了971与Aβ的结合情况,结果发现971可能与APP跨膜区GXXXG区域结合。上述计算机模拟结果提示我们,971可能通过靶向APP跨膜区,与C99特异结合,改变C99构象,从而减少Aβ1-42生成,下调Aβ42/Aβ40。本论文综合利用现代药理学和分子生物学技术,结合计算机模拟技术,发现971通过影响Aβ前体蛋白APP的成熟过程,抑制Aβ生成,同时,通过靶向APP跨膜区,改变C99构象,专一性抑制Aβ42的生成,下调Aβ42/Aβ40,进一步减少线粒体内Aβ寡聚化,发挥线粒体功能保护作用。本研究首次确定了971靶向线粒体功能保护发挥抗AD的药效特性,为其作用机制的系统阐明及进一步临床研究和应用开发奠定了重要的理论基础。而971通过抑制APP成熟从而减少Aβ生成这一机制,为抗老年痴呆提供了β-分泌酶和γ-分泌酶抑制剂之外的一种全新思路,本文的另一重大发现。